新城疫病毒鴨源分離株NDV08-004微型基因組與全基因組的構(gòu)建.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的一種烈性傳染病。新城疫病毒的基因組為不分節(jié)段、單股負(fù)鏈RNA。目前已經(jīng)報(bào)道的NDV基因組全長(zhǎng)有15186、15192和15198核苷酸(nucleotide，nt)三種形式。根據(jù)其基因組特性，新城疫病毒可分為Ⅰ類(ClassⅠ)和Ⅱ類(ClassⅡ)兩種。ClassⅠ NDV在國(guó)際上少有報(bào)道，除

2、了曾在愛爾蘭發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒力的毒株外，其他僅在海、河岸邊生活的禽類和健康家禽中分離到，且為無毒力或弱毒力。我國(guó)于2008年首次報(bào)道ClassⅠ NDV，此后多地也發(fā)現(xiàn)此類NDV。
　　 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心對(duì)2008年分離到的一株鴨源NDV弱毒NDV08-004株進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定，通過NDV分子流行病學(xué)分析顯示該分離株在分類地位上屬于ClassⅠ，與近年來香港活禽市場(chǎng)分離株較為相似，同屬于基因3型，并且發(fā)現(xiàn)P基因的非編碼

3、區(qū)比ClassⅡ NDV多出了12nt。為了解12nt出現(xiàn)的意義、鴨源NDV各基因的功能、NDV跨種間傳播的機(jī)理、新型疫苗的研制以及不同類別NDV的差異和聯(lián)系，可通過建立NDV反向遺傳技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行研究。本研究在NDV08-004株全基因組序列測(cè)定的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了該基因組cDNA的全長(zhǎng)克隆，以及該毒株的微型基因組轉(zhuǎn)錄載體和NP、P、L基因的三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，通過病毒的體外包裝技術(shù)，成功表達(dá)綠色熒光蛋白。
　　 ㈠NDV08-004

4、株新城疫病毒的微型基因組以及NP、P基因輔助性質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定。
　　 參照GenBank上公布的鴨源NDV08-004株全基因組序列，設(shè)計(jì)NP、P基因的引物，通過RT-PCR方法從NDV08-004株NDV感染的尿囊液中擴(kuò)增得到目的片段后，分別克隆進(jìn)T載體pGEM-T Easy Vector中，再亞克隆到真核表達(dá)載體pCI-neo上，構(gòu)建了NP、P基因的真核表達(dá)載體pCI-NP、pCI-P。質(zhì)粒pCI-NP、pCI-P采用酶切、

5、PCR方法鑒定的結(jié)果與預(yù)期大小一致；質(zhì)粒pCI-NP、pCI-P各轉(zhuǎn)染多個(gè)真核細(xì)胞48h后，通過間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence，IIF)試驗(yàn)?zāi)苡^察到明顯的黃綠色熒光。這些結(jié)果表明輔助表達(dá)質(zhì)粒pCI-NP、pCI-P具備在真核細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能。
　　 參照NDV08-004株全基因組序列和eGFP-C1質(zhì)粒圖譜，設(shè)計(jì)Leader、Trailer、GFP三對(duì)引物，其中Leader和GFP

6、、GFP和Trailer之間互有對(duì)方的overlap部分，通過RT-PCR和普通PCR方法擴(kuò)增得到目的片段，再通過overlap PCR方法將三者相連構(gòu)成長(zhǎng)度為1032bp的LGT片段，符合“六堿基規(guī)則”，再與經(jīng)SmaⅠ和StuⅠ酶切的轉(zhuǎn)錄載體pOLTV5連接，構(gòu)建了NDV08-004株的微型基因組。
　　 ㈡NDV08-004株新城疫病毒的全基因組轉(zhuǎn)錄載體及L基因輔助性質(zhì)粒構(gòu)建。
　　 根據(jù)NDV08-004株全基因組

7、序列設(shè)計(jì)9對(duì)引物，通過RT-PCR方法從NDV08-004株NDV感染的尿囊液中擴(kuò)增得到目的片段后，分別克隆進(jìn)T載體pGEM-T Easy Vector中，再將這9對(duì)引物的擴(kuò)增片段分別依次連接構(gòu)建四個(gè)中間質(zhì)粒LTP-T、ABC-T、DE-T、FG-T，再依次亞克隆到LGT-04質(zhì)粒中，從而構(gòu)建了含有NDV基因組cDNA全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄載體ND08004-pO。
　　 L基因分段引物E'的擴(kuò)增片段克隆進(jìn)T載體pGEM-TEasy Vec