鴨腸炎病毒部分基因組序列的克隆與分析.pdf

1、鴨病毒性腸炎(Duckviralenteritis，DVE)，又名鴨瘟(Duckplague，DP)，是由鴨腸炎病毒(Duckenteritisvirus，DEV)引起的鴨、鵝及多種雁形目動(dòng)物的一種急性、熱性、敗血性傳染病。DEV系皰疹病毒科成員之一，其分子生物學(xué)方面的研究十分有限，相對(duì)落后于其它皰疹病毒，其基因組結(jié)構(gòu)和物理圖譜尚屬未知。目前已知DEVTK、UL24和gH基因ORF，對(duì)于UL6、UL7和UL30基因僅己知部分核苷酸序列，

2、其基因組90％以上屬于未知，與此相關(guān)的基礎(chǔ)研究，如病毒的基因功能以及病毒在機(jī)體細(xì)胞和組織中的復(fù)制機(jī)理、病毒感染過(guò)程以及機(jī)體抗病毒感染機(jī)制等多方面研究均有許多不明之處。同時(shí)，與此相關(guān)的預(yù)防、控制等措施以及基于基因組序列的基因工程疫苗的研究應(yīng)受到重視。 本實(shí)驗(yàn)研究主要以蝕斑純化株DEVClone-03的基因組未知序列為主要對(duì)象，以分子生物學(xué)技術(shù)為主要手段，提供病毒基因分子特性，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。首先進(jìn)行DEV的蝕斑純化、增殖以及P

3、CR檢測(cè)；然后使用靶基因步行PCR(targetedgenewalkingPCR)方法擴(kuò)增DEV基因組未知序列；之后進(jìn)行病毒基因的ORF預(yù)測(cè)和序列分析；最后進(jìn)行UL6基因的原核表達(dá)及融合蛋白兔體高免血清的制備。 用CEF單層細(xì)胞對(duì)DEV疫苗株進(jìn)行蝕斑純化，將蝕斑純化毒命名為DEV克隆疫苗(DEVClone-03)株，將此毒通過(guò)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚。根據(jù)GenBank發(fā)表的DEVLA(LakeAndes)株UL6基

4、因部分核苷酸序列(登錄號(hào)：AF043730)設(shè)計(jì)引物P1和P2；根據(jù)GenBank發(fā)表的DEV疫苗(DP-VAC)株UL30區(qū)域核苷酸序列(登錄號(hào)：AF064639)設(shè)計(jì)引物P11和P12，用這兩對(duì)引物對(duì)DEVClone-03進(jìn)行PCR檢測(cè)。用P1和P2引物檢測(cè)DEVClone-03在雞胚體內(nèi)的分布，結(jié)果表明：接毒死亡雞胚的尿囊膜、心、肝、脾、肺、腎和肌肉皮膚內(nèi)均存在病毒；PCR敏感試驗(yàn)表明此方法可以檢測(cè)到100μl尿囊液中提取的10-

5、3稀釋的病毒DNA。收取接毒死亡雞胚尿囊液，磷鎢酸負(fù)染電鏡觀(guān)察，可以見(jiàn)到典型的皰疹病毒粒子。 TargetedgenewalkingPCR方法是以一段已知序列為出發(fā)點(diǎn)，采用特異性引物與非特異性引物相結(jié)合的方法擴(kuò)增已知序列周?chē)奈粗蛄胁糠?，從而使已知序列不斷延伸。本?shí)驗(yàn)以DEVClone-03基因組DNA為模板，用此方法擴(kuò)增DEVClone-03基因組未知序列，結(jié)果表明targetedgenewalkingPCR方法擴(kuò)增DNA病

6、毒基因組未知序列切實(shí)可行。選取兩段核苷酸序列作為擴(kuò)增起始點(diǎn)，其中一段是UL6區(qū)域的由引物P1和P2擴(kuò)增的516bp核苷酸序列(A)，另一段是UL30區(qū)域的由引物P11和P12擴(kuò)增的234bp核苷酸序列(B)。以A為起點(diǎn)擴(kuò)增得到9732bp片段，從中預(yù)測(cè)到7個(gè)基因ORF，它們編碼的多肽分別與單純皰疹病毒1型(Herpessimplexvirus1，HSV-1)的UL1、UL2、UL3、UL4、UL5、UL6和UL7蛋白具有同源性，將這7個(gè)

7、基因分別命名為DEVClone-03的UL1、UL2、UL3、UL4、UL5、UL6和UL7HSV-1同源基因，各基因ORF大小依次為711bp、474bp、720bp、714bp、2568bp、2373bp和966bp，編碼氨基酸數(shù)量依次為236、157、239、237、855、790和321。以B為起點(diǎn)擴(kuò)增得到17841bp的片段，從中預(yù)測(cè)到7個(gè)基因ORF，它們編碼的多肽分別與HSV-1的UL25、UL26、UL26.5、UL27、

8、UL28、UL29和UL30蛋白具有同源性，將這7個(gè)基因分別命名為DEVClone-03的UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29和UL30HSV-1同源基因，各基因ORF大小依次為1797bp、2124bp、1074bp、3003bp、2412bp、3585bp和3621bp，編碼氨基酸數(shù)量依次為598、707、357、1000、803、1194和1206。除了UL2，其余基因均符合預(yù)計(jì)大小。 在皰疹病毒

9、尤其是α皰疹病毒中UL1～UL7和UL25～UL30基因的排列規(guī)律相對(duì)保守。如DEVClone-03UL1～UL7基因的排列與HSV-1和馬立克氏病病毒血清1型(Marek'sdiseaseherpesvirus1，MDV-1)同源基因的排列順序均相似，其UL25～UL30基因的排列與馬皰疹病毒1型(Equidherpesvirus1，EHV-1)和馬立克氏病病毒血清2型(Marek'sdiseaseherpesvirus2，MDV-2

10、)同源基因排列相一致。因此DEV基因組UL區(qū)段基因組成可能與其他多數(shù)皰疹病毒基因組UL區(qū)段基因組成相似。 對(duì)以上14個(gè)基因進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明：DEVClone-03與α皰疹病毒同源性較之與β皰疹病毒和γ皰疹病毒的同源性要高。在氨基酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，DEVClone-03屬于α皰疹病毒亞科，就UL3、UL4、UL5、UL26、UL26.5、UL27、UL28和UL30基因而言，DEVClone-03與MDV更接近。因此，就

11、UL1～UL7和UL25～UL30基因的綜合序列分析而言，DEVClone-03歸屬為α皰疹病毒亞科，與MDV更接近。因此預(yù)測(cè)DEV將來(lái)有可能歸類(lèi)為α皰疹病毒亞科的馬立克氏病病毒屬。當(dāng)然，對(duì)于DEV歸屬的深入研究還需要大量的分子生物學(xué)資料為基礎(chǔ)。 14個(gè)基因編碼的氨基酸序列分析表明：DEVClone-03多數(shù)基因比較保守，或者編碼的蛋白具有皰疹病毒同源蛋白的保守基序。如UL1蛋白aa110～137位具有α皰疹病毒gL蛋白相對(duì)保守

12、的氨基酸殘基，N端9～25位富含疏水氨基酸殘基。UL3蛋白aa193～197位具有同HSV相同的保守的核內(nèi)定位信號(hào)序列RKPRK。UL5蛋白具有保守的6個(gè)解旋酶基序，在每個(gè)保守的解旋酶基序中具有同樣的解旋酶超家族保守的氨基酸殘基。UL6蛋白aa463～484位存在一個(gè)推測(cè)的保守的亮氨酸拉鏈(leucinezipper，ZIP)基序。UL26蛋白具有兩個(gè)保守的組氨酸(H)，分別位于aa94位和aa128位；同時(shí)，在aa278～282位有保

13、守的R位點(diǎn)(YLQAS)，在aa675～678位有保守的M位點(diǎn)(VDAS)。UL26.5蛋白C末端具有同HSV-1相似的保守序列A-X-X-F-I-X-Q-M-M-X-X-R，X表示任意氨基酸殘基。UL27蛋白中推測(cè)到11個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)。UL28蛋白有兩個(gè)高保守區(qū)，并且在aa512～514位有RRK，與SuHV-1ICP18.5蛋白的核內(nèi)定位信號(hào)序列相似。UL29蛋白具有保守的DNA結(jié)合功能區(qū)和金屬結(jié)合區(qū)域，DNA結(jié)合功能區(qū)位于a

14、a805～851位，其氨基酸組成是R-X3-R-X9-F-X9-F--X1-K-X12-W-X6-R，推測(cè)的金屬結(jié)合區(qū)域位于aa503～520位，其氨基酸組成是C-X2-C-X9-H-X3-H，X表示任意氨基酸殘基，下腳標(biāo)數(shù)字表示氨基酸殘基的數(shù)量。UL30蛋白具有DNA聚合酶相對(duì)保守的功能區(qū)域。由此推測(cè)上述基因可能與其他皰疹病毒同源基因具有相似的功能。 為了進(jìn)一步研究UL6蛋白的特性，將DEVClone-03UL6基因分為互相重

15、疊的兩段進(jìn)行了原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA金屬螯合層析柱純化后，得到純化的His-taggedUL6-1和His-taggedUL6-2融合蛋白。取純化蛋白免疫兔體制備高免血清，結(jié)果表明免疫后血清與相應(yīng)免疫原蛋白產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。 總之，本研究使用targetedgenewalkingPCR方法擴(kuò)增DEVClone-03基因組序列27573bp，首次獲得14個(gè)基因ORF，這將為病毒基因組研究奠定基礎(chǔ)，也為DEV歸屬和致病性