鴨腸炎病毒gE基因部分功能研究與轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建.pdf

1、鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE），又名鴨瘟（Duck plague，DP），是由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。DEV屬皰疹病毒科未分類病毒，具有皰疹病毒典型的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。糖蛋白E（gE）是皰疹病毒的主要囊膜蛋白之一，由us8基因編碼。皰疹病毒gE是病毒復(fù)制非必須的，對病毒毒力和在細(xì)胞與

2、細(xì)胞間的直接傳播起重要作用，能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，是重組疫苗、亞單位疫苗和皰疹病毒血清學(xué)診斷方法的候選抗原。因此，對gE的研究不僅對了解病毒分子生物學(xué)功能特征有重要意義，對臨床診斷、疾病預(yù)防、基因工程疫苗研究也很重要。
　　 目前還未見到有關(guān)DEV gE基因及其編碼產(chǎn)物的深入研究。本試驗(yàn)以DEV gE基因?yàn)檠芯繉ο?，采用PCR技術(shù)克隆了DEV C-KCE株gE基因，并對該基因與其他皰疹病毒的同源性、編碼蛋白的

3、結(jié)構(gòu)及抗原性等做了較為詳盡的生物信息學(xué)分析。在此基礎(chǔ)上利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pET30a（+）（E. Coli Rosetta），分別表達(dá)了gE成熟蛋白（pET-gE）、gE成熟蛋白胞外區(qū)（pET-gEBW）及gE成熟蛋白胞內(nèi)區(qū)（pET-gEBN），經(jīng)SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小分別為60 Kda、50 Kda及20 Kda，Western blot分析表達(dá)產(chǎn)物均可與DEV陽性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。選擇表達(dá)量高、抗原性好的pET

4、-gEBW蛋白，切膠純化后免疫家兔制備了兔抗DEV-gE的多克隆抗體，經(jīng)Western blot和IFA鑒定，表明制備的多抗血清反應(yīng)性良好，能與全病毒反應(yīng)并可識別病毒上的gE天然糖蛋白。
　　 通過間接免疫熒光試驗(yàn)確定gE的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)熒光主要集中于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。兔抗DEV-gE血清噬斑減數(shù)中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，制備的血清具有中和活性，證明糖蛋白gE上含有中和抗原表位。為進(jìn)一步探究gE蛋白的功能，通過病毒與兔抗DEV-gE抗

5、體作用的方法，研究了gE蛋白對DEV的吸附、侵入、細(xì)胞到細(xì)胞間直接傳播（CTCS）的作用。結(jié)果表明，添加兔抗DEV-gE抗體后試驗(yàn)組相比對照組吸附率降低了18.19％，差異顯著（p<0.05），說明gE蛋白對病毒的吸附過程有一定作用；但添加兔抗DEV-gE抗體后試驗(yàn)組與對照組侵入率分別為53.24％和51.39％，差異不顯著，說明gE蛋白可能不參與病毒的侵入過程；此外，添加兔抗DEV-gE抗體能夠降低病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物上的滴度，并促使DE

6、V在CEF單層細(xì)胞上形成的噬斑變小，實(shí)驗(yàn)組和對照組差異顯著（p<0.05），證明糖蛋白gE參與了病毒在細(xì)胞與細(xì)胞間直接傳播的過程。
　　 此外，本實(shí)驗(yàn)利用PCR方法擴(kuò)增DEV C-KCE株gE基因同源臂片段（包含gI基因及其側(cè)翼序列），擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體測序后亞克隆至pUC19 EcoRⅠ、SaIⅠ位點(diǎn)間，獲得pUC-gE。將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)盒插入pUC-gE BamHⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pUC-gE-EGFP