表達(dá)1型鴨肝炎病毒VP1基因重組鴨腸炎病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、1型鴨病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis，DVH)是幼齡雛鴨的一種高度致死性、急性傳染病。該病以發(fā)病急速、傳播快速、死亡率高為主要特征，以肝炎和出血為主要病理變化，臨診表現(xiàn)角弓反張。VP1蛋白含有多個(gè)與細(xì)胞結(jié)合的表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和中和抗體，是鴨肝炎病毒主要的毒力決定因素。鴨病毒性腸炎(Duck Viral Enteritis，DVE)，又名鴨瘟(Duck Plague，DP)，是鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種

2、急性、熱性、敗血性傳染病。
　　 本研究以鴨腸炎病毒(DEV)為載體，構(gòu)建表達(dá)1型鴨肝炎病毒(DHV-1)VP1蛋白的重組鴨腸炎病毒，為鴨肝炎病毒的基因工程疫苗的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增DHV-1 VP1基因，測(cè)序正確后將其克隆至pcDNA3.1(+)載體，然后擴(kuò)增含有pCMV、VP1和BHG pA的表達(dá)盒；同時(shí)以質(zhì)粒pEASY-Blunt Simple-EGFP和pMD18-T-GPT為模板，PC

3、R擴(kuò)增EGFP表達(dá)盒和GPT表達(dá)盒；以DEV DNA為模板，PCR擴(kuò)增US4左右臂基因。然后依次將EGFP表達(dá)盒、VP1表達(dá)盒、同源臂基因和GPT表達(dá)盒克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建重組病毒轉(zhuǎn)移載體pMD18-T-VP1-GPT-EGFP。將重組病毒轉(zhuǎn)移載體與DEV DNA共轉(zhuǎn)染次代鴨胚成纖維細(xì)胞，經(jīng)過(guò)同源重組和加壓篩選純化，獲得純病毒，經(jīng)PCR、RT-PCR、Western blot及IFA鑒定后命名為重組病毒DEV/△gG/VP1。

4、電鏡觀察DEV和DEV/△gG/VP1病毒粒子，結(jié)果表明DEV和DEV/△gG/VP1具有相同的形態(tài)結(jié)構(gòu)；并且DEV/△gG/VP1病毒粒子能夠與兔抗DHV-1 VP1多克隆抗體形成免疫復(fù)合物，表明DEV/△gG/VP1能夠表達(dá)VP1蛋白，并且VP1蛋白表達(dá)在病毒粒子表面。將100TCID50DEV和DEV/△gG/VP1分別接種于原代鴨胚成纖維細(xì)胞，在不同時(shí)間收集病毒，測(cè)定病毒效價(jià)，繪制病毒生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明DEV在72h左右病毒效價(jià)

5、達(dá)到高峰，高于DEV/△gG/VP1效價(jià)，DEV/△gG/VP1在96h左右效價(jià)達(dá)到高峰，說(shuō)明US4基因的缺失和外源基因的插入并沒(méi)有影響病毒的增殖，但其增殖時(shí)間相對(duì)滯后。分別接種100TCID50親本病毒與重組病毒，測(cè)定其在低熔點(diǎn)瓊脂糖中形成的噬斑大小直徑，結(jié)果表明兩者形成的噬斑大小直徑無(wú)顯著差異，表明US4基因的缺失和外源基因的插入并沒(méi)有影響病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞中的傳播。提取第10、15、20代重組病毒DEV/△gG/VP1 DNA擴(kuò)