侵染藠頭的病毒種類鑒定及其部分病毒序列基因組特性分析.pdf

1、藠頭（Allium chinense G.Don）為百合科蔥屬多年生植物，其起源地為亞洲，是一種具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的傳統(tǒng)蔬菜作物。而蓖頭病毒病是致使藠頭產(chǎn)量和品質(zhì)大幅降低的主要因素。本文在田間病害調(diào)查的基礎(chǔ)上，利用生物學(xué)、血清學(xué)以及病毒粒子形態(tài)和感病植物細(xì)胞病理特征觀察，結(jié)合分子生物學(xué)方法，對(duì)來自武漢江夏區(qū)的藠頭病毒樣品進(jìn)行了種類鑒定，并對(duì)所獲病毒克隆基因組部分序列特性進(jìn)行了分析，確定了該藠頭產(chǎn)區(qū)侵染的病毒至少包括三個(gè)屬4種病毒，主要研

2、究結(jié)果如下：
　　 1.明確發(fā)生在江夏區(qū)藠頭存在復(fù)合感染現(xiàn)象。通過在湖北省武漢市江夏區(qū)藠頭田間病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)田間菖頭植株表現(xiàn)為花葉、褪綠條紋、植株扭曲、黃化等癥狀；通過汁液摩擦接種到6種指示植物上，確定部分藠頭病毒病的繁殖寄主為昆諾藜；利用4個(gè)不同感病樣品的粗提液，經(jīng)負(fù)染后電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有3種不同的病毒粒子形態(tài)，包括桿狀、線型（歪曲和直線型）；直接采取感病蓖頭葉片制作超薄切片，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)感病寄主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量的馬鈴薯Y病毒

3、屬（Potyvirus）成員特異的風(fēng)輪狀（橫切）或柱狀（縱切）內(nèi)含體。
　　 2.首次發(fā)現(xiàn)侵染我國(guó)藠頭的馬鈴薯Y病毒屬OYDV病毒分離物。利用馬鈴薯Y病毒屬內(nèi)成員基因組簡(jiǎn)并引物，結(jié)合通用引物M4，獲得該屬基因組3’端序列大小約1.7kb的擴(kuò)增片段，對(duì)該片段進(jìn)行了克隆和序列測(cè)定，其全長(zhǎng)為1625個(gè)核甘酸，包括部分NIb（636bp）、全長(zhǎng)CP基因（771bp）和3’端UTR序列。將所獲克隆基因組3’端核甘酸序列在數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，發(fā)

4、現(xiàn)所獲病毒克隆基因組3’端區(qū)域與洋蔥黃矮病毒（Onion vellow dwarf virus，OYDV）相同區(qū)域的核甘酸同源性最近，最高達(dá)99％。外殼蛋白基因的核甘酸和推測(cè)氨基酸序列與已報(bào)道的OYDV分離物CP相應(yīng)區(qū)域同源性分別為80％-99％和87％-99％；構(gòu)建了CP基因核甘酸和編碼外殼蛋白氨基酸序列進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，所獲克隆基因組CP序列與來自大蒜上的OYDV云南分離物OYDV-YN2（GenBank登錄序列號(hào)AJ409313）

5、、兩個(gè)江蘇分離物OYDV-JS2（登錄序列號(hào)AJ409310）、OYDV-JS1（登陸序列號(hào)AJ293278）及日本分離物OYDV-Gzm（登錄序列號(hào)AB000840）相同區(qū)域同源性均很高（≥97％），聚成一簇。將該分離物暫命名為0YDV-WH，這是OYDV病毒侵染我國(guó)藠頭的首次報(bào)道。
　　 3.首次發(fā)現(xiàn)侵染我國(guó)藠頭的香石竹潛隱病毒屬7個(gè)不同克隆。利用香石竹潛隱病毒屬內(nèi)成員基因組簡(jiǎn)并引物，結(jié)合引物M4，獲得該屬基因組3’端核甘酸

6、序列，共9個(gè)克隆，大小為1808-1812個(gè)核甘酸，序列特性分析表明，其包含病毒RNA基因組全長(zhǎng)的第3-6共4個(gè)閱讀框（ORF）。序列比對(duì)顯示，這些克隆與現(xiàn)有報(bào)道的大蒜潛隱病毒（Garlic latent virus，GLV）基因組3’端相同區(qū)域的核苷酸序列最為接近，同源性分別在75％-82％之間，9個(gè)克隆中有7個(gè)克隆在該區(qū)域的核苷酸差異比較大，同源性在77％-93％之間。CP序列比對(duì)分析表明，所獲得克隆基因組CP序列與目前報(bào)道的GLV

7、基因組CP核苷酸和氨基酸同源性分別在75％-87％和88％-97％之間，其中克隆P2和car1-5基因組序列結(jié)構(gòu)最相似，與日本藠頭上的分離物GLV-Rjpn（登錄序列號(hào)AB004565）氨基酸同源性最接近，達(dá)97％。本研究獲得的具有較大序列差異的7個(gè)克隆之間基因組CP核苷酸和氨基酸的同源性分別76％-89％和88％-100％。外殼蛋白核甘酸序列進(jìn)化樹分析表明，7個(gè)克隆分別與其他GLV分離物共形成4個(gè)不同進(jìn)化族，其中P4克隆CP核甘酸進(jìn)化

8、樹上形成獨(dú)立一族，且其核甘酸數(shù)量也有較大差異，因此，推測(cè)該克隆很可能為香石竹潛隱病毒屬的一個(gè)新種。將所獲的克隆基因組序列第3個(gè)ORF（編碼蛋白TGB2）、第4個(gè)ORF（編碼蛋白TGB3）和第6個(gè)ORF（編碼核酸結(jié)合蛋白NABP）分別與已知報(bào)道的GLV基因組對(duì)應(yīng)區(qū)域序列進(jìn)行比對(duì)分析表明，氨基酸序列同源性分別為71％-90％、59％-85％、82％-95％。ORF3、ORF4、ORF6基因變異比ORF5基因變異要大些，其中ORF4變異最大，

9、而ORF5變異主要發(fā)生在其編碼氨基酸的N末端。根據(jù)Carlavirus屬分類標(biāo)準(zhǔn)-不同病毒CP氨基酸同源性小于68％，同一病毒不同株系間為75％-90％。因此推斷本研究所獲得的克隆是屬于GLV不同的分離物。這是我國(guó)藠頭上的首次發(fā)現(xiàn)侵染GLV病毒。
　　 利用所獲病毒克隆基因組RNA3’端序列設(shè)計(jì)RNA基因組部分中間片段下游特異性簡(jiǎn)并引物pCarl-2dW（-）和上游簡(jiǎn)并引物pCare-2（+），RT-PCR擴(kuò)增獲得包含病毒GLV

10、基因組的第2個(gè)ORF2及部分ORF1的片段。序列結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，ORF1和ORF2之間有30個(gè)核甘酸的非編碼區(qū)。ORF2與ORF3有23個(gè)核苷酸重疊區(qū)域。ORF2共含有708個(gè)核苷酸，編碼TGB1蛋白，將所獲病毒克隆基因組ORF2區(qū)域序列片段與現(xiàn)有報(bào)道的相關(guān)病毒相同區(qū)域比對(duì)分析，結(jié)果顯示該病毒基因組ORF2也存在較大的變異，核甘酸和氨基酸同源性分別在72％-78％和76％-83％。
　　 4.首次發(fā)現(xiàn)侵染我國(guó)蓖頭的利用蔥X病毒屬2

11、個(gè)不同病毒。利用蔥X病毒屬內(nèi)成員基因組簡(jiǎn)并引物，結(jié)合引物M4，獲得該屬基因組3’端序列約1.0kb擴(kuò)增片段，共8個(gè)克隆。其中克隆。pGTdw-8基因組3’端序列含有939個(gè)核甘酸，其它7個(gè)克隆均為949個(gè)核甘酸（代號(hào)為pGTdw-15），包括部分CP基因（441個(gè)核甘酸）、完整NABP全長(zhǎng)基因381個(gè)核甘酸和3’端非編碼區(qū)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)Blast序列分析表明，克隆pGTdw-8基因組3’端序列與現(xiàn)有報(bào)道的蔥X病毒屬我國(guó)大蒜上發(fā)現(xiàn)的大蒜病毒E

12、（GarV-E，AJ292230）分離物相同區(qū)域核甘酸序列最相似，同源性達(dá)94％。另一個(gè)克隆pGTdw-15與大蒜病毒X韓國(guó)分離物（GarV-X，U892413）相同區(qū)域核甘酸序列最相似，具有91％的同源性，序列系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，本研究所獲蔥X病毒屬相關(guān)病毒克隆基因組3’端的核甘酸進(jìn)化樹與完整的NABP核甘酸進(jìn)化樹存在較大的進(jìn)化族相關(guān)性和一致性。同時(shí)，基因組3’端UTR非翻譯區(qū)序列的比對(duì)結(jié)果顯示，本研究所得克隆pGTdw-8基因組3’端U