表達(dá)外源基因的HCV微型基因組的構(gòu)建及初步應(yīng)用研究.pdf

1、病毒基因組復(fù)制是其生活周期中的重要環(huán)節(jié)。已知正鏈RNA病毒的復(fù)制分為兩個(gè)步驟，一是正鏈RNA作為模板生成復(fù)制中間體負(fù)鏈RNA；二是負(fù)鏈RNA又作為模板去合成子代正鏈RNA。復(fù)制酶是依賴RNA的RNA聚合酶（RdRP），非編碼區(qū)（UTR）是病毒基因組復(fù)制的主要調(diào)控區(qū)域，其中3′UTR是復(fù)制酶結(jié)合的主要區(qū)域，介導(dǎo)基因組的從頭合成。在深入理解病毒復(fù)制機(jī)制及復(fù)制所需作用元件的基礎(chǔ)上，構(gòu)建RNA病毒微型基因組是近年來分子病毒學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。

2、它有利于闡明病毒復(fù)制的分子機(jī)制、成熟與包裝中所需的蛋白因子，并為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)提供新策略。
　　丙型肝炎病毒（HCV）屬黃病毒科，為單股正鏈RNA病毒。HCV基因組全長約9.6Kb，含有單一開放讀框(ORF)，兩側(cè)為非編碼區(qū)（5′UTR和3′UTR）。HCV基因組具有高度變異性，存在“準(zhǔn)株”現(xiàn)象，主要有六個(gè)基因型和多個(gè)亞型。而HCV基因組序列分析表明，與復(fù)制密切相關(guān)的順式作用元件高度保守，它們主要存在于5′UTR和3′UTR，以

3、及core和ns5b基因的部分序列。NS5B蛋白具有RdRP活性，是HCV復(fù)制的關(guān)鍵酶。它與其它非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白（如NS3、NS4A、NS4B等）形成復(fù)制酶復(fù)合物，錨定于細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上發(fā)揮其生物功能。這一系列研究為構(gòu)建HCV微型基因組提供了條件。
　　新型HCV治療藥物是各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前關(guān)于HCV的治療是主要以干擾素為基礎(chǔ)的治療方案，但效果有限而且副作用大，患者依從性差。具有很大潛力的小分子藥物，如針對(duì)NS3/4A蛋白酶、解

4、旋酶及RNA聚合酶NS5B的抑制劑，臨床試驗(yàn)顯示常常引起耐藥突變體。因此，迫切需要尋找新的抗HCV策略，其中靶向治療HCV感染細(xì)胞的方法是有潛力的方向之一。
　　本研究首先通過基因重組技術(shù)用順式作用元件構(gòu)建了HCV微型基因組，中間為反向插入的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因（fireflyluciferase，flu)與EMCV的IRES基因。該微型基因組RNA在病毒復(fù)制酶的作用下，從3′末端起始合成負(fù)鏈RNA，反向插入的flu及IRES基

5、因即轉(zhuǎn)換為正向，flu得以表達(dá)。然后，設(shè)計(jì)了幾種不同截短的微型基因組，由它們生成的負(fù)鏈RNA的3′末端具有不同莖環(huán)截短的突變形式，以報(bào)告基因flu的表達(dá)水平來比較這一系列微型基因組。在此基礎(chǔ)上，利用該微型基因組表達(dá)IFN-β，靶向抑制HCV感染細(xì)胞。本研究分以下三個(gè)部分：
　　1.HCV微型基因組的構(gòu)建與功能鑒定
　　根據(jù)Genbank登錄的HCV1b型基因序列，設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增HCV5UTR1-377、3UTR，其中擴(kuò)增5

6、UTR1-377的引物上游含有T7啟動(dòng)子核心序列；分別設(shè)計(jì)并擴(kuò)增IRES（來自EMCV）、flu基因；合成HDV核酶Rz(ribozyme)的正義與反義序列，兩者退火；將PCR產(chǎn)物各片段克隆至pMD18T載體，交由公司測序。序列鑒定正確后依次將5UTR、IRES、3UTR、HDVRz片段克隆入pUC18載體，形成質(zhì)粒pUC18-T7/5UTR-rIRES-3UTR-HDVRz,縮寫為pT7/5UrI3URz。然后通過XbaI單酶切位點(diǎn)將

7、flu基因插入上述載體，PCR鑒定正反向后，命名反向插入flu的載體為pT7/5UrFI3URz，即為HCV微型基因組。HCV復(fù)制子質(zhì)粒BB7經(jīng)ScaI酶切線性化，在T7RNA聚合酶作用下體外轉(zhuǎn)錄制備RNA，通過電穿法轉(zhuǎn)染Huh7.5細(xì)胞，經(jīng)G418壓力篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞克隆，RT-PCR和Westernblot證實(shí)成功構(gòu)建了該復(fù)制子細(xì)胞系，命名為Huh7.5BB7。將pT7/5UrFI3URz質(zhì)粒經(jīng)EcoR?酶切線性化，體外轉(zhuǎn)錄制備微型

8、基因組RNA，通過電穿轉(zhuǎn)染方法將其導(dǎo)入Huh7.5BB7細(xì)胞和Huh7.5細(xì)胞，48hr后處理細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光素酶選擇性表達(dá)于Huh7.5BB7細(xì)胞，提示已成功構(gòu)建HCV微型基因組。
　　2.不同HCV微型基因組截短體的比較
　　從3′末端起始的從頭合成是HCV復(fù)制的形式。負(fù)鏈RNA3′UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，除了3′末端的最短的SL-A1莖環(huán)外，其它莖環(huán)與正鏈RNA5′UTR均不同。目前，對(duì)于

9、負(fù)鏈RNA3′UTR的各個(gè)莖環(huán)在正鏈RNA的從頭合成中作用尚不清楚。本研究依次構(gòu)建了幾種截短的微型基因組（?45、?124、?227、?131-315），由它們生成的負(fù)鏈RNA的3′末端具有不同莖環(huán)截短的突變形式。將這幾種微型基因組體外轉(zhuǎn)錄制備微型基因組RNA，轉(zhuǎn)染Huh7.5BB7細(xì)胞。48hr后測定熒光素酶活性，結(jié)果顯示：與全長微型基因組相比，?131-315微型基因組表達(dá)熒光素酶活性增強(qiáng)（p<0.01），而?45微型基因組表達(dá)熒光

10、素酶活性降低（p<0.01），?124、?227微型基因組基本不表達(dá)熒光素酶。
　　3.利用微型基因組特異表達(dá)IFN-β靶向抑制HCV感染細(xì)胞
　　長效干擾素（PEG-IFN）聯(lián)合利巴韋林是目前HCV最為標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。但各個(gè)基因型的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率（SVR）不同，1型和4型僅為38～52％。其中一個(gè)重要原因是HCV編碼蛋白通過多種途徑抵抗了IFN的抗病毒反應(yīng)。本研究將IFN-β基因反向插入微型基因組，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在病毒

11、復(fù)制酶作用下合成負(fù)鏈微型基因組RNA后啟動(dòng)IFN-β表達(dá)，從而發(fā)揮抗病毒作用。首先從外周血中分離淋巴細(xì)胞，用polyI:C刺激其分泌IFN。用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增IFN-β基因。序列鑒定正確后，將其克隆入pT7/5U?131-315rI3URz，PCR鑒定插入的正反向，將反向插入的質(zhì)粒命名為pT7/5U?131-315rIFNI3URz。該重組質(zhì)粒用EcoRI酶切后純化，體外轉(zhuǎn)錄制備RNA，轉(zhuǎn)染H

12、uh7.5BB7細(xì)胞，48hr后收集細(xì)胞并提取蛋白?？笽FN-β抗體作為一抗，Western-blot分析顯示：IFN-β特異性表達(dá)于復(fù)制子細(xì)胞中。用XbaI線性化HCV全長基因組質(zhì)粒JFH-1后，體外轉(zhuǎn)錄制備RNA并轉(zhuǎn)染Huh7.5細(xì)胞，IncellWestern-blot和熒光實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)建立了Huh7.5JFH-1細(xì)胞系。為了利用HCV微型基因組進(jìn)行靶向基因治療，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增微型基因組5U?131-315rIFNI3URz后

13、克隆入pcDNA3.1載體，獲得pCMV-5U?131-315rIFNI3URz。將其轉(zhuǎn)染復(fù)制子細(xì)胞系，Western-blot顯示IFN-β能夠特異的表達(dá)于復(fù)制子細(xì)胞系中。pCMV-5U?131-315rIFNI3URz轉(zhuǎn)染huh7.5JFH-1細(xì)胞系后，熒光實(shí)時(shí)定量PCR顯示，它可以降低HCVRNA的拷貝水平，具有一定的劑量依賴效應(yīng)。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建了HCV微型基因組，對(duì)其表達(dá)外源基因的構(gòu)建方式進(jìn)行了優(yōu)化；攜帶I