HCV 1b亞基因組復(fù)制子細(xì)胞模型的建立及藥物初步篩選.pdf

1、丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)是丙型肝炎的致病體，丙型肝炎是世界范圍內(nèi)的重要傳染病之一。據(jù)估計，目前世界上有1.7億多人感染該病毒，占人口總數(shù)的3％。HCV大部分感染者發(fā)展成慢性肝炎，并最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌。目前對HCV的預(yù)防和治療十分有限，迄今還沒有疫苗問世。對HCV感染者最有效的治療方法為聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率對基因型有很強(qiáng)的依賴性，即不同的基因型對治療反應(yīng)差異很大。此外，其治療費(fèi)用頗高

2、，且具有顯著的副作用。因此，迫切需要更加有效的治療方法。但是，這方面的研究進(jìn)展不明顯，主要原因是沒有合適的細(xì)胞模型可以有效支持HCV病毒的復(fù)制。 直到1999年，復(fù)制子模型的出現(xiàn)使HCV細(xì)胞模型的研究向前邁了一大步。HCV亞基因組復(fù)制子模型使病毒復(fù)制子第一次在人源肝癌細(xì)胞系中大量復(fù)制，成為HCV病毒研究的有效工具。 本研究利用構(gòu)建成功的中國人群中HCV1b亞基因組復(fù)制子質(zhì)粒，采用體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得HCV1b亞基因組復(fù)制子

3、RNA，并通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞系Huh—7.5.1，經(jīng)過G418藥物篩選6周后，獲得了大量高效復(fù)制HCV1b亞基因組復(fù)制子的細(xì)胞集落。在此工作基礎(chǔ)上，為了篩選到具有穩(wěn)定遺傳和高效復(fù)制的細(xì)胞單克隆，我們在獲得的細(xì)胞集落中，挑選90個單克隆進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，最終得到三個具有穩(wěn)定遺傳和高效復(fù)制的細(xì)胞單克隆。本研究運(yùn)用RT-PCR技術(shù)和WesternBlot技術(shù)驗證細(xì)胞中HCV亞基因組復(fù)制子的存在，并且通過Real-TimePCR檢測細(xì)胞中

4、HCV亞基因組復(fù)制子的拷貝數(shù)，進(jìn)一步證實了該細(xì)胞模型中存在HCV1b亞基因組復(fù)制子，并存在大量的拷貝。 與此同時，本研究采用干擾素-α和利巴韋林處理細(xì)胞模型，檢測到細(xì)胞中HCV亞基因組復(fù)制子的拷貝數(shù)明顯下降，成功模擬了藥物篩選的過程，為未來的抗病毒藥物的篩選和評價提供有力的工具和實驗方法。 同時，本研究還通過原核表達(dá)體系和昆蟲桿狀病毒表達(dá)體系表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白，目的是獲得HCV亞基因組中各非結(jié)構(gòu)蛋白，用于抗病毒機(jī)制的研