一種含EGFP報(bào)告基因的HCV復(fù)制子瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建和驗(yàn)證.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是丙型肝炎的致病體，全世界約有1.7億丙肝感染者。HCV感染可有多種不同的臨床表現(xiàn)，而大部分感染者發(fā)展成慢性肝炎，從而更易演變?yōu)楦斡不透渭?xì)胞癌。由于丙型肝炎的嚴(yán)重危害，近年來(lái)，丙型肝炎病毒的研究特別是病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展十分迅猛。1999年Lohmann等在Science上首先報(bào)道了選擇性雙順?lè)醋觼喕蚪MHCV RNA復(fù)制子系統(tǒng)，復(fù)制子在人肝癌細(xì)胞系Huh7中能高水平自主復(fù)制

2、，這被公認(rèn)為是HCV RNA體外復(fù)制模型研究獲得突破性進(jìn)展的里程碑。復(fù)制子系統(tǒng)的建立，對(duì)HCV致病機(jī)制、治療藥物篩選及疫苗方面的研究具有重要的意義。 本工作意在構(gòu)建一種能直觀快速反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)HCV RNA數(shù)量的重組HCV 1b復(fù)制子，而無(wú)需利用G418篩選后再通過(guò)RT-PCR來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的HCV RNA，對(duì)于定性評(píng)價(jià)某種化合物對(duì)于HCV的抗性有重要意義。該重組載體構(gòu)建的基本思路為：利用AscⅠ和PmeⅠ酶切位點(diǎn)將HCV 1b亞基因

3、組復(fù)制子內(nèi)的G418抗性基因neo片段切下，同時(shí)利用PCR方法獲得術(shù)端加入了上述兩種酶切位點(diǎn)的EGFP片段，通過(guò)體外連接得到了一種不含G418抗性基因，而含有EGFP報(bào)告基因的重組HCV1b亞基因組克隆pEGFP-1b；該cDNA克隆經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)錄，得到了重組的HCV 1b亞基因組RNA，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后，卻并未如預(yù)期結(jié)果檢測(cè)到細(xì)胞熒光。然而工作中在相同實(shí)驗(yàn)條件下利用pEGFP-N1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ituh7細(xì)胞，能觀