一種含EGFP報告基因的HCV復(fù)制子瞬時表達載體的構(gòu)建和驗證.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是丙型肝炎的致病體，全世界約有1.7億丙肝感染者。HCV感染可有多種不同的臨床表現(xiàn)，而大部分感染者發(fā)展成慢性肝炎，從而更易演變?yōu)楦斡不透渭毎Ｓ捎诒透窝椎膰?yán)重危害，近年來，丙型肝炎病毒的研究特別是病毒分子生物學(xué)研究進展十分迅猛。1999年Lohmann等在Science上首先報道了選擇性雙順反子亞基因組HCV RNA復(fù)制子系統(tǒng)，復(fù)制子在人肝癌細胞系Huh7中能高水平自主復(fù)制

2、，這被公認(rèn)為是HCV RNA體外復(fù)制模型研究獲得突破性進展的里程碑。復(fù)制子系統(tǒng)的建立，對HCV致病機制、治療藥物篩選及疫苗方面的研究具有重要的意義。 本工作意在構(gòu)建一種能直觀快速反應(yīng)細胞內(nèi)HCV RNA數(shù)量的重組HCV 1b復(fù)制子，而無需利用G418篩選后再通過RT-PCR來檢測細胞內(nèi)的HCV RNA，對于定性評價某種化合物對于HCV的抗性有重要意義。該重組載體構(gòu)建的基本思路為：利用AscⅠ和PmeⅠ酶切位點將HCV 1b亞基因

3、組復(fù)制子內(nèi)的G418抗性基因neo片段切下，同時利用PCR方法獲得術(shù)端加入了上述兩種酶切位點的EGFP片段，通過體外連接得到了一種不含G418抗性基因，而含有EGFP報告基因的重組HCV1b亞基因組克隆pEGFP-1b；該cDNA克隆經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄，得到了重組的HCV 1b亞基因組RNA，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細胞后，卻并未如預(yù)期結(jié)果檢測到細胞熒光。然而工作中在相同實驗條件下利用pEGFP-N1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Ituh7細胞，能觀