含有紅色熒光報(bào)告基因玉米CobA的T載體和表達(dá)載體構(gòu)建研究.pdf

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：至￡：!蒸薹時(shí)間：甲厶年占月易日關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定

2、，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：璽絲!疰羞研究生簽名：絲!施亟第一導(dǎo)師簽名時(shí)間：爐／年6只卜Et時(shí)間：矽／。年鄉(xiāng)月／日摘要尿卟啉原III甲基化酶(Uroporphyrinogenmethyltransferase，UPMT)是

3、維生素B12的分支合成關(guān)鍵酶，也是一種新型熒光蛋白。但是，和綠色熒光蛋白相比，它的應(yīng)用研究報(bào)道較少。本文以玉米UPMT作為篩選標(biāo)記，分別研究了基因插入和融合表達(dá)對(duì)重組大腸桿菌菌落紅色熒光的影響，取得如下結(jié)果：1分析了玉米UPMT編碼基因cobA在大腸桿菌不同啟動(dòng)子下的本底表達(dá)。結(jié)果表明：cobA基因在Lac，T5，Trc和Tac啟動(dòng)子下均有本底表達(dá)，轉(zhuǎn)化菌斑呈紅色；但是，它在T7和araBAD啟動(dòng)子下無(wú)本底表達(dá)。2分析了玉米UPMT編碼

4、基因cobA在Lac啟動(dòng)子下不同菌株的表達(dá)水平。結(jié)果表明：DH5a、JMl09、XLBlucl和TGl菌株形成的菌斑，長(zhǎng)紫外燈下菌落熒光沒有明顯差異。3構(gòu)建了基于玉米UPMT插入失活的大腸桿菌T載體，分析了不同長(zhǎng)度片段的插入效果和插入一個(gè)500bp片段的克隆效率。結(jié)果表明：250bp，370bp，420bp，1000bp和1800bp不同長(zhǎng)度片段均能裝入該T載體。該T載體中插入TCA三核苷酸，編碼一個(gè)Ser殘基(為T載體中TXA編碼分子

5、量最小的氨基酸殘基)，導(dǎo)致重組菌落紅色熒光消失。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，500bp插入的克隆效率為92％，和傳統(tǒng)的基于a肽插入失活的T載體克隆效率相似。4初步分析了插入失活的機(jī)制。在T載體中插入一個(gè)Ser殘基的突變體導(dǎo)致UPMT蛋白突變體表達(dá)為包涵體，表明插入?yún)^(qū)域參與重組蛋白的折疊。5利用定點(diǎn)突變構(gòu)建3個(gè)麥芽糖結(jié)合蛋I蘭t(MBP)的突變體，即折疊缺陷型(G32D)、兩種包涵體類型(分別為A264D和G32D／133P)。它們的的C端分別

6、融合表達(dá)Q肽，電泳分析結(jié)果表明：A264D，G32D／133P兩個(gè)突變體蛋白均在沉淀中表達(dá)，而折疊缺陷型G32D突變體蛋白在上清和沉淀中都有表達(dá)。6利用野生型和突變體MBP的C端Q肽所具有的B一半乳糖苷酶活性，檢測(cè)蛋白的折疊和水溶性。結(jié)果表明，兩者呈高度正相關(guān)。7用UPMT分別取代野生型和突變體MBP的C端0【肽。熒光分析結(jié)果表明：它與MBP的折疊和水溶性呈現(xiàn)正相關(guān)，和0【肽活性檢測(cè)的結(jié)果一致。綜上所述，玉米UPMT作為篩選標(biāo)記，在構(gòu)建