RHD基因不同轉(zhuǎn)錄子表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、目的:目前，Rh(D)抗原在紅細(xì)胞膜的表達(dá)機(jī)制仍不清楚，研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)可能依賴于一個(gè)復(fù)合體。其中，RHD基因存在多種不同的另路剪接轉(zhuǎn)錄子，它們很可能參與了D抗原的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建RHD基因幾種不同轉(zhuǎn)錄子的真核重組表達(dá)載體，其中包括正常RHDcDNA，以及和正常RhD mRNA序列最相近的DEL9、DEL89轉(zhuǎn)錄子，期望為探討Rh(D)抗原表達(dá)機(jī)制及復(fù)合體組成成分奠定相關(guān)基礎(chǔ)。
　　 方法:收集Rh(D)陽性新生兒臍血，利用血

2、清學(xué)及分子生物學(xué)方法分別鑒定其Rh表型和基因型:鹽水試管法鑒定其Rh表型，包括RhD、C、c、E和e抗原;RHD基因型的鑒定則通過提取樣本DNA，用檢測部分D型的試劑盒對RHD基因10個(gè)外顯子進(jìn)行檢測，以確認(rèn)其實(shí)屬于包含所有10個(gè)外顯子的Rh(D)陽性樣本。利用全血總RNA提取試劑盒從此臍血網(wǎng)織紅細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)設(shè)計(jì)的不同引物，分別采用一步法和兩步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因片段，再切膠并溶膠純化目的基

3、因;將純化后的基因片段連接至TOPO TA克隆測序載體pCR4-TOPO，通過轉(zhuǎn)化至TOP10大腸桿菌、以適量菌液均勻涂布至含氨芐青霉素的普通瓊脂平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)，其后，隨機(jī)挑取單一菌落至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中37℃水平震搖過夜增菌篩選培養(yǎng)，隨后以堿裂解法提取純化質(zhì)粒，再對提取的質(zhì)粒進(jìn)行測序，挑選出序列完整無突變的質(zhì)粒;以該篩選質(zhì)粒為模板，使用設(shè)計(jì)的新引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增為構(gòu)建表達(dá)載體用的目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化

4、，再將其連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO，通過再次轉(zhuǎn)化至大腸桿菌、篩選增菌培養(yǎng)，提取并純化質(zhì)粒，最后經(jīng)質(zhì)粒測序篩選出含有序列正確、無突變目的基因，且插入方向正確的重組質(zhì)粒。
　　 結(jié)果:血清學(xué)鹽水試管法初步檢測結(jié)果顯示2份樣本均為Rh(D)陽性，Rh表型分別為DCcEe和DCCee;基因分型結(jié)果再次驗(yàn)證兩樣本均為Rh(D)陽性樣本:沒有發(fā)生外顯子缺失。其后，成功提取樣本總RNA，一步法RT-PCR擴(kuò)增共

5、獲得五個(gè)轉(zhuǎn)錄子條帶，分別為正常RHDcDNA，DEL9，DEL89，DEL79及DEL789。由于目的條帶較弱，隨后采用兩步法RT-PCR獲得正常RHDcDNA條帶，紫外燈下切膠后溶膠純化，而DEL9和DEL89轉(zhuǎn)錄子則直接合成。含上下游非編碼區(qū)的RHDcDNA成功克隆至TOPO TA克隆測序載體，經(jīng)過克隆篩選、質(zhì)粒序列分析結(jié)果顯示:獲得的片段中含有正常無突變RHD基因編碼區(qū)序列（包含基因上下游非編碼區(qū)的序列），以此含RHDcDNA的篩

6、選質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得從起始密碼子至終止密碼子的RHD基因編碼區(qū)全長序列（不含上下游非編碼區(qū)）。之后將大量擴(kuò)增后獲得的RHDcDNA、以及DEL9和DEL89分別成功克隆至pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表達(dá)載體，經(jīng)過篩選克隆、測序驗(yàn)證，三種目的基因片段序列完整無突變且插入方向均正確，從而成功構(gòu)建3種不同RHD轉(zhuǎn)錄子的真核表達(dá)載體。
　　 結(jié)論:實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了正常RHDcDNA、以及DEL9和DEL89轉(zhuǎn)錄子