利用新型人源打靶載體構(gòu)建基因定點修復的熒光報告系統(tǒng).pdf

1、理想的基因治療應該具備以下三方面的要求:基因治療的有效性、基因治療的靶向性和基因治療的安全性.近年來出現(xiàn)的寡核苷酸介導的基因定點修復策略,可針對基因位點的缺陷進行原位矯正,使修復的基因能夠在其本身的染色質(zhì)環(huán)境和調(diào)控序列調(diào)節(jié)下進行適宜水平的表達,是基因治療的理想模式,具有比傳統(tǒng)策略更明顯的優(yōu)越性.從寡核苷酸修復術(shù)的發(fā)展過程考慮,本文建立一種靈敏、方便、穩(wěn)定、可靠的報告系統(tǒng).實驗證明,本系統(tǒng)直接、快速、準確地測定了定點修復事件的發(fā)生,結(jié)果穩(wěn)

2、定,為機制研究建立了良好的實驗平臺.在本系統(tǒng)研究中,發(fā)現(xiàn)寡核苷酸的作用表現(xiàn)出明顯的鏈偏向性,即針對正義鏈的打靶分子起效,而與之互補的另一條打靶分子幾乎沒有修復作用,支持了Kmiec和Yoon等人提出的SSO作用的轉(zhuǎn)錄相關(guān)因素.結(jié)合本實驗室前期研究所發(fā)現(xiàn)的提高效率的復制相關(guān)因素,我們認為寡核苷酸的定點修復作用是包括轉(zhuǎn)錄、復制、錯配修復等與細胞功能密切相關(guān)的多因素、多環(huán)節(jié)共同參與、作用的結(jié)果,不能簡單用一種機制解釋.本實驗室曾發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫代修飾

3、的SSO修復后發(fā)光細胞喪失了正常的分裂能力而無法獲得糾正后的細胞克隆,因此我們利用新獲得的細胞系繼續(xù)對這一現(xiàn)象進行了觀察,初步判斷了SSO的修復對細胞分裂能力的影響.在有效提高寡核苷酸介導的基因定點修復效率的基礎上,下一步的工作中,我們將利用AS-PCR、PCR-RFLP、DNA測序、Southern blot、Westernblot等多種檢測方法,從多水平驗證靶位點的特異性改變,在該實驗平臺基礎上,結(jié)合本實驗室前期工作,進行更加完整而