核糖體基因區(qū)打靶載體介導FVIII打靶人胚胎干細胞及其定向分化研究.pdf

1、人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)因其具有高度的自我更新特性和多向分化潛能，在再生醫(yī)學、組織工程、基因治療等領域都有著巨大的研究和應用潛力。近年來，隨著基因打靶技術在人胚胎干細胞中的不斷嘗試，使得經基因組精確修飾后的干細胞有望成為實現遺傳病治療的有效方式。然而要充分實現聯合基因打靶和干細胞兩種技術在臨床應用的可能，我們還需面對一些潛在的困難，例如自發(fā)同源重組介導基因打靶的低效性，基因組修飾后

2、的安全性等問題。
　　我們研究小組前期的實驗證實，由本室研發(fā)的核糖體基因區(qū)(rDNA)打靶載體(pHrn)能有效介導外源基因定點整合至多種細胞系的rDNA區(qū)并有效表達，且一系列臨床細胞遺傳學的證據表明該區(qū)域可能是外源基因停泊的安全位點。在此基礎上，本研究利用pHrn攜帶人凝血因子Ⅷ(FⅧ)表達框，對hESCs進行基因打靶，以期獲得在rDNA區(qū)定點整合FⅧ的hESCs細胞克隆，并通過檢測打靶后hESCs的干細胞特性是否改變來初步驗證

3、rDNA區(qū)打靶的安全性。然后將定點整合FⅧ的hESCs分化為適合血友病移植治療的特定組織細胞，測定分化細胞的特性和生理功能，為聯合rDNA區(qū)基因打靶及干細胞技術應用于血友病A的基因治療提供基礎。
　　方法:(1)將pHrnFⅧ質粒線性化后，經電轉和核轉兩種方式轉染單細胞化的hESCs，梯度加入G418篩選抗性克隆;(2)挑取篩選出的抗性克隆，利用定點整合PCR及Southen Blot鑒定rDNA區(qū)定點整合FⅧ的陽性hESCs克隆

4、;(3)檢測定點整合FⅧ克隆的干細胞生物學特性,包括核型鑒定，堿性磷酸酶染色，干細胞表面標志物檢測;(4)檢測定點整合FⅧ克隆的多潛能性，包括體外定向心肌分化，體外隨機向三胚層細胞分化以及體內畸胎瘤形成等實驗。(5)由于肝臟是FⅧ的主要合成及分泌器官，因此我們將定點整合FⅧ細胞克隆定向誘導為肝細胞，并通過形態(tài)學觀測、細胞特異性基因表達、ICG代謝、PAS糖原染色等實驗來驗證分化后肝細胞的特性及生理功能;(6)我們還將定點整合FⅧ的細胞克

5、隆定向誘導為目前廣泛應用于體內移植治療的間充質干細胞(MSCs)，通過形態(tài)學觀測、流式細胞分析、成骨分化、成脂分化、成軟骨分化等驗證分化后MSCs細胞的特性及生理功能;(7)RT-PCR及ELISA檢測定點整合FⅧ的hESCs以及分化后的肝細胞和MSCs細胞中外源FⅧ的轉錄及蛋白表達。
　　結果:(1)通過定點整合PCR及Southern Blot，我們獲得了分別經電轉和核轉后定點整合FⅧ的hESCs克隆各一個，分別命名為ET5及

6、NT59;(2)兩株細胞均保持正常核型且堿性磷酸酶陽性，并表達SSEA-4，TRA-1-60等hESCs特異性標志物，表明仍具備干細胞的特性;(3)體外分化結果顯示兩株細胞均能分化出Nestin、SMA、AFP標志物陽性的三胚層細胞，同時體內畸胎瘤切片觀測到了鱗狀上皮、肌肉、消化道等三胚層組織，表明打靶后細胞仍具備多向分化能力;(4)將ET5細胞進行定向肝細胞分化后，可見圓形或多邊形等典型肝細胞樣細胞;通過RT-PCR、Western

7、Blot、免疫熒光均檢測到了AFP、Alb、AAT、CYP7A1、CYP3A4等肝細胞特異性基因的表達;分化而來的肝細胞能成功攝取及排泌ICG染料且PAS染色陽性，初步證明具備成熟肝細胞的代謝及糖原貯存功能;(5) ET5進行定向MSCs分化后的細胞，在多次傳代后具有與BM-MSCs趨于一致的典型成纖維樣形態(tài)，且增殖能力旺盛;流式分析結果表明分化而來的MSCs細胞表面抗原CD34，CD45陰性，CD44，CD73，CD90陽性，與BM-

8、MSCs一致;經間充質系分化檢測，顯示分化而來的MSCs同樣具備向成骨成脂成軟骨的分化能力;(6)RT-PCR檢測結果發(fā)現，在ET5、ET5分化而來的肝細胞及MSCs細胞中均能檢測到外源FⅧ的轉錄，但是ELISA結果僅檢測到了分化后肝細胞中FⅧ蛋白的表達。
　　結論:(1)通過rDNA區(qū)打靶載體成功將FⅧ表達框定點整合至hESCs的rDNA區(qū);(2)定點整合FⅧ的hESCs仍然保持多向分化潛能;(3)成功將定點整合FⅧ的hESCs