pepck啟動(dòng)子調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1、 中 國(guó) 醫(yī) 學(xué) 科 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) AC T AAC ADE MI AEME DI CI N AES I NI C AEP E P C K啟動(dòng)子調(diào)控的報(bào)告 基 因表達(dá)質(zhì)粒 的構(gòu)建 馮凱王妲孫琦 肖新華( 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國(guó)協(xié)和 醫(yī)科大學(xué) 北京和醫(yī)院內(nèi)分泌科 ，北京 1 0 0 7 3 0 )· 論 著 ·摘要 目的構(gòu)建磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 ( P E P C K )基因啟動(dòng)子調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，為評(píng)價(jià)P E

2、 P C K啟動(dòng)子對(duì)下游 基因的轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié) 創(chuàng)造條件 。方法從載體質(zhì)粒 p P E P C K - i n t 中截取大小為 5 5 0b p的大鼠 P E P C K啟動(dòng)子片 段 ，借助過渡載體質(zhì)粒 P B S ． P E P C K，將 P E P C K啟動(dòng)子片段插入 p G L 2 - B a s i c - L u c報(bào)告質(zhì)粒 。結(jié)果 通 過酶切鑒定及基 因測(cè)序 ，證 明 p G L 2 ． P E P C K ． L u c

3、熒光素 酶表達(dá)質(zhì)粒 構(gòu)建成功 ，并能夠在體外 表達(dá)熒光素酶 。結(jié)論 p G L 2 - P E P C K - L u c質(zhì)?？勺鳛轶w外研究 P E P C K啟動(dòng)子轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié)的新手段 。關(guān) 鍵詞 重 組 質(zhì) 粒 基 因調(diào) 控 磷 酸 烯醇 式 丙 酮 酸 羧 激 酶 中 圖號(hào) R 3 9 4 ． 3Co n s t r u c t i o na n dI d e n t i f i c a t i o no fRe c o m b i

4、 n a n tF i r e f l yL u c i f e r a s eRe p o r t e rP l a s m i dp GL2 - - P E PCK - - L u cF e n gK a iWa n gH e n gS u nQ iX i a oX i n - h u a( D e p a r t m e n to fE n d o c r i n o l o g y ，P U MCHo s p i t a 1 ．

5、C AMSa n dP U MC ，B e i j i n g1 0 0 7 3 0 ，C h i n a )O b j e c t i v eT oe v a l u a t ei nv i t r or e g u l a t i o no fp h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y k i n a s e( P E P C K ) g e n ep r o m o t e

6、 ro ng e n et r a n s c r i p t i o n ， a n dc o n s t r u c tl u c i f e r a s er e p o r t e rp l a s mi dp GL 2 - P E P C K- L u c ． M e t h o d sA5 5 0b pf r a g me n to fP E P C Kp r o mo t e rc u tf r o m p l a sm

7、i dp P E P C K． i n tw a si n s e r t e di n t ot r a n s i t i o n a lv e c t o rP B S ． S Kt oc o n s t r u c tat r a n s i t i o np l a s mi dP B S ． P E P C K．T h e nt h er e c o mb i n a n tl u c i f e r a s er e p

8、o r t e rp l a s mi dp GL 2 ． P EP C K．L u cwa sc l o n e d ． Re s u l t sR e s t r i c t i o ne n z y me sa n dn u c l e o t i d es e q u e n c ec o n f o r me dt h a tt h ec o u p l i n gs i t eo fr e c o mb i n a n tp

9、 l a s mi dw a sc o r r e c tw i t h o u tb a s emu t a t i o na n dd e l e t i o n ，a n dt h es e q u e n c ei n s e r t e dwa st h es a mea s d a t ao fGe n e B a n k ．T h el u c i f e r a sec o u l db ee x p r e s s

10、e di nh e p a t o mac e l lt r a n s f e c t e db yp G L 2 ． P E P C K．L u c ．Co n c l u s i o nE s t a b l i s h e dan e wme a n st os t u d yt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no fP E P C Kp r o mo t e r ．K

11、e ywo r d smc o mb i n a n tp l a s mi d ；g e n er e g u l a t i o n ；p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y k i n a s eA e t aA c a dM e dS i n ，2 0 0 4 ， 2 6 ( 5 ) ： 5 6 2 — 5 6 5肝 臟 中 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 激 酶

12、 ( p h o s p h o e n —o l p y r u v a t ec a r b o x y k i n a s e ， P E P C K )是體內(nèi)糖原異生 的關(guān) 鍵 酶 ，其 表 達(dá) 可被 胰 高 糖 素 和 皮 質(zhì) 激 素 等 活 化 ，并被體內(nèi)胰島素所抑制。在 1 型糖尿病的發(fā)病初期 ，患者體內(nèi)胰島素分泌嚴(yán)重缺乏 ，胰 島 O t 細(xì)胞反應(yīng)性分泌增加 ，導(dǎo)致 出現(xiàn)胰高糖素與胰 島素比值增 高 ，此時(shí) P E P

13、C K啟動(dòng) 子被 高 度活化 。如果在 糖 尿病 狀 態(tài) 下借用這一啟動(dòng)子調(diào)節(jié)胰島素的分泌 ，可以實(shí)現(xiàn)胰 外可調(diào)節(jié) 的胰島素分泌【 l 】 ，因此 國(guó)際上將 P E P C K啟#C o r r e s p o n d i n ga u t h o rT e l ：0 1 0 — 6 5 2 9 5 0 7 4 ．F a x ：0 1 0 — 6 5 2 9 5 0 7 1動(dòng) 子作 為糖 尿病基 因治 療 的候 選基 因_ 2 】 。目

14、前 關(guān) 于 P E P C K啟 動(dòng) 子 的基 因表 達(dá) 調(diào) 控研 究 ，國(guó) 際 上 多 采 用 氯 霉 素 已 酰 轉(zhuǎn) 移 酶 ( c h l o r a mp h e n i c o la e e t y h r a n s f e r a s e ， C A T )報(bào)告 系統(tǒng) ，它是利用 同位素作 為測(cè) 定標(biāo)志 ，檢 測(cè)時(shí) 間長(zhǎng)，分 析靈敏 度不 高 。因此本 研 究 構(gòu)建 了由 P E P C K啟 動(dòng)子 調(diào)控 的熒 光 素酶

15、表 達(dá)質(zhì) 粒，以期為進(jìn)一步在體外研究 P E P C K啟動(dòng)子順反式調(diào)節(jié) 創(chuàng)造條件 維普資訊 http://www.cqvip.com 中 國(guó) 醫(yī) 學(xué) 科 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 圖 3 重 組 質(zhì)粒 p G L 2 - P E P C K — L u c 的測(cè) 序結(jié) 果 F i g3T h er e s u l to fs u r v e y i n gs e q u e n c eo fr e c o mb i n a n tp l a s

16、 mi dp G L 2 - P E P C K- L u c重組質(zhì)粒 p G L 2 一 P E P C K — L u c熒光素 酶的表達(dá) 活 性 經(jīng)過 B — G a l 矯 正后 ，分別轉(zhuǎn) 染 p G L 2 一 P E P C K — L u c與 p G L 2 一 B a s i c ． L u c 質(zhì) 粒 的細(xì)胞熒 光 素酶相 對(duì) 活性 為 1 1 ． 7 5 ±l 。 5 4和 1 ． 3 6± 0

17、 。 1 8 ，兩 者相 比差異 有顯 著 性 ( 尸<0 。 0 1 ) ，說 明重組 質(zhì)粒能 夠在 C B R H 7 9 1 9 細(xì) 胞 中表達(dá)熒光 素酶 ( 圖 4 ) 。言》黽_ 詈．蘭童1 51 O5OB a c k g r o u n dp G L2p G L 2B AS I CP EP CK p l a s m i d圈 4p G L 2 - B a s i c與 p G L 2 - P E P C K轉(zhuǎn)染 C B

18、 R H 7 9 1 9細(xì)胞后熒 光 素酶 活性 的 比較 F i g4C o m p a r i s o no fl u c i f e r a s ea c t i v i t ye x p r e s s e db yC B R H7 9 1 9c e l la f t e rp G L 2- B a si ca n dp G L 2 - P E P C Kt r a n s f e e t i o nP<0 ． O1c o

19、 mp a r e dw i t hp G L 2 一 B A S I Cp l a s m i d討 論 載體質(zhì)粒 p P E P C K — i n t 中含有 大小為 5 5 0b p的大 鼠 P E P C K啟動(dòng)子片段 ，在片段兩端各 有一個(gè)單一 酶切 位點(diǎn) S p e l 和 S a c 1 。為了構(gòu)建包含這段序列 調(diào)控的熒光 素酶報(bào)告質(zhì)粒 ，必須將 片段插入p G L 2 ． B a s i c ． L u c的多克隆

20、位點(diǎn) 區(qū)域 ，但 酶切 圖譜顯 示這段 區(qū)域并 不含 有 相應(yīng) 的 S p e l 酶 切 位 點(diǎn) ，而 在質(zhì) 粒 p P E P C K ． i n t中的 P E P C K啟 動(dòng) 子 上 游 只能 找 到 S p e l 酶 切 位點(diǎn) ，這就 為構(gòu)建報(bào) 告質(zhì)粒 帶來(lái) 了困難 。一般 的克 隆策略 5 6 4O ~o b e r ，2 0 0 4是將 片段 和載 體 的末端 補(bǔ) 平 ，如先 用 K l e n o wD N A聚合酶

21、 將連 接端補(bǔ) 平 ，再 進(jìn)行平端 連接 ，但這種 克隆方法 連 接效率較 低 ，可 出現(xiàn) 目的片段 的 串聯(lián) ，產(chǎn)生非 重組 子的可能性 較高 ，另外 目的 片段 會(huì) 以正反 兩個(gè)方 向與 載體連 接 ，在篩 選 陽(yáng)性 克 隆時(shí)還要進(jìn) 行 連接 片段正 反方 向的鑒定 ，工作量 較 大，質(zhì)粒構(gòu) 建 成功率低 。通 過對(duì) P E P C K片段上酶切 位點(diǎn)與報(bào)告 質(zhì)粒酶切 圖譜 的分析 比 較 ，很 難選 出適 當(dāng)?shù)拿盖形?點(diǎn)進(jìn)行正反方

22、向的鑒定。另一種克隆方案是首先將片段 的 S a c l 端 與報(bào)告 質(zhì)粒 的相應(yīng) 末端 進(jìn)行 粘端 連接 ，然后用 K l e n o w酶 補(bǔ)平另一端 ，再進(jìn)行平 端連接 。這 種 方 法 中間 步驟 過 于繁瑣 ，另 外 由 于 K l e n o wD N A聚合酶還 具有外 切酶 的活性 ，常常將 片段末端 堿基 切 除掉 ，從 而破 壞 了序列 的完 整性 。因此選擇 構(gòu)建 中間過 渡質(zhì)粒不失為一種明智 的選擇 。通 過 對(duì)

23、 p P E P C K — i n t 、p G L 2 一 B a s i c ． L u c 與 P B SS K3 種質(zhì)粒 酶切 圖譜 的對(duì) 比分析筆 者發(fā)現(xiàn) ， P B S — S K質(zhì)粒 的多克隆 位點(diǎn) 中不 僅含 有片段 兩端 的單一酶切 位點(diǎn) ，而且 重組 后 的 中間過 渡 載體 質(zhì) 粒 P B S — P E P C K，與 報(bào)告質(zhì) 粒 p G L 2 - B a si c — L u c的多 克隆位 點(diǎn) 區(qū)域 ，共

24、 同存在 S m a 1 和 S a c 1 單一酶切位點(diǎn)，通過一平一粘的定 向連接保 證 了調(diào) 控序列 方 向與載體 一致。 由于質(zhì)粒 P B S — S K的多克 隆 區(qū)域 含 有大 量 的單 一酶 切位 點(diǎn) ，用它 作為 中間載體 ，可 為今后將 這段 目的序列 應(yīng) 用于構(gòu) 建其他質(zhì) 粒 ，提供 了更大 的選擇空 間。正是借助于 P B S — S K質(zhì)粒的多酶切位點(diǎn)的特點(diǎn) ，本研 究成功地構(gòu) 建了 p G L 2 ． P E P