牙鲆vasa基因的克隆、表達(dá)分析及其啟動(dòng)子調(diào)控的GFP報(bào)告載體構(gòu)建.pdf

1、原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells，PGCs）是有性生殖動(dòng)物生殖細(xì)胞的祖細(xì)胞，在早期胚胎中形成后遷移到性腺原基，并最終產(chǎn)生卵和精子。Vasa屬于ATP依賴的RNA解旋酶中DEAD-box家族。自發(fā)現(xiàn)以來，vasa被認(rèn)為是生殖細(xì)胞最可信的分子標(biāo)記之一，在生殖系的起源、發(fā)育以及配子形成過程中發(fā)揮重要作用。牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我國最重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類之一，對(duì)其生殖發(fā)育以及優(yōu)良種質(zhì)資源保存

2、的研究具有重要意義。本文克隆了牙鲆Po-vasa的全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行了序列特征分析和表達(dá)分析。通過染色體步移技術(shù)獲得Po-vasa啟動(dòng)子序列，并構(gòu)建了啟動(dòng)子調(diào)控的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報(bào)告載體pvasa-EGFP，為將來追蹤和分離牙鲆PGCs奠定基礎(chǔ)。
　　牙鲆Po-vasa cDNA全長(zhǎng)2461 bp，其中ORF1941 bp，編碼646個(gè)氨基酸。5?UTR為175 bp，3?U

3、TR為345 bp。預(yù)測(cè)的氨基酸序列具有 DEAD-box家族蛋白所共有的9個(gè)保守結(jié)構(gòu)域以及普遍存在于許多物種 Vasa蛋白 N末端的RG和RGG重復(fù)序列。結(jié)合染色體步移技術(shù)，最終得到牙鲆基因組中11443bp的片段。該片段包括了6927 bp的牙鲆vasa基因全長(zhǎng)，3333 bp的5?側(cè)翼區(qū)和1183 bp的3?側(cè)翼區(qū)。Po-vasa基因全長(zhǎng)共23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子，起始密碼子位于外顯子II中。
　　熒光定量PCR分析顯示，

4、在十種不同組織中Po-vasa的表達(dá)僅限于性腺，其中卵巢內(nèi)的表達(dá)水平顯著高于精巢內(nèi)的表達(dá)水平；胚胎發(fā)育早期 Po-vasa為母源性表達(dá)，原腸胚期之前表達(dá)量高且較穩(wěn)定，在原腸期表達(dá)量驟降，低水平表達(dá)持續(xù)到孵化后1天。
　　通過對(duì)Po-vasa的PCR擴(kuò)增及測(cè)序，發(fā)現(xiàn)存在10種選擇性剪接產(chǎn)生的不同的5?部分序列，而3?部分未見差異。因此推測(cè)牙鲆vasa基因至少存在10種選擇性剪接異構(gòu)體，編號(hào) A~J。A為本實(shí)驗(yàn)最初克隆到的也是最主要的

5、一種轉(zhuǎn)錄本。異構(gòu)體J由于缺失了8個(gè)堿基導(dǎo)致了移碼突變，其他異構(gòu)體則均包含DEAD家族的9個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。對(duì)異構(gòu)體B~J進(jìn)行相對(duì)定量分析結(jié)果表明，不同異構(gòu)體在性腺中的表達(dá)量不同，F(xiàn)表達(dá)量最高；同種異構(gòu)體在精巢和卵巢的表達(dá)量也存在差異，如E和F。這些異構(gòu)體在早期胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式也不盡相同。因此，不同異構(gòu)體可能行使著不同的功能。
　　利用多種在線分析軟件對(duì) Po-vasa3.3kb的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析。在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TS

6、S上游31 bp處有1個(gè)典型的TATA box。啟動(dòng)子區(qū)存在GATA-1、C/EBP、AP-1、SP-1、Oct-1、MZF1、c-Myc、SRY、Sox-5、AML-1a、HNF-3B等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及多個(gè)糖皮質(zhì)激素受體GR的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)其可能對(duì)Po-vasa的調(diào)控起到關(guān)鍵作用。
　　PCR擴(kuò)增Po-vasa的5和3調(diào)控序列，與增強(qiáng)型綠色色熒光蛋白（EGFP）基因連入載體，構(gòu)建牙鲆Po-vasa啟動(dòng)子調(diào)控的GFP報(bào)告載體