構(gòu)建攜帶IGF-1和GFP基因的柞蠶核型多角體病毒雙啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移載體.pdf

1、本研究的目的是構(gòu)建帶有IGF-1基因和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，簡稱 GFP)基因的柞蠶核型多角體病毒雙啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移載體。 首先，根據(jù)苜蓿銀紋夜蛾和家蠶的核型多角體病毒 IE-1 基因上游序列，設(shè)計(jì)同源引物，克隆了柞蠶核型多角體病毒 IE-1 基因啟動(dòng)子片段，并與最近登陸在Gene Bank的同源序列比對，結(jié)果顯示同源性極高，與家蠶和斜紋夜蛾多角體病毒的 IE-1 啟動(dòng)子相比，具有早期基因啟

2、動(dòng)子特點(diǎn)。將IE-1 基因啟動(dòng)子插入到質(zhì)粒pGFP-N2的GFP基因上游，構(gòu)建了IE-1/pGFP-N2表達(dá)載體。通過轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，證明克隆的啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄活性，表達(dá)載體構(gòu)建成功。IE-1 基因啟動(dòng)子是桿狀病毒的極早期基因啟動(dòng)子，侵入細(xì)胞后就會(huì)迅速激活下游基因表達(dá)，有利于快速簡便的篩選重組病毒。 其次，選取 SV40 polyA 作為 IG-1 的終止序列，通過PCR對其擴(kuò)增并構(gòu)建了它

3、的克隆載體 pMD-SV40 polyA; 以 IE-1/pGFP-N2 為模版，擴(kuò)增帶有IE-1 基因啟動(dòng)子的GFP，使擴(kuò)增的Pie-GFP兩端帶有EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建出pMD-Pie-GFP克隆載體。因?yàn)镮GF-1為小分子肽類活性物質(zhì)，為了提高它的表達(dá)量，構(gòu)建了IGF-1 串聯(lián)拷貝數(shù)分別為一至四的多拷貝克隆載體 pUC-IGF-1(1-4)-SV40 polyA，本實(shí)驗(yàn)利用BamH Ⅰ和aglⅡ是同尾酶，它們作用酶切位點(diǎn)后產(chǎn)生

4、相同的粘性末端序列，并且連接后酶切位點(diǎn)消失的原理，逐步插入IGF-1 得到多拷貝克隆載體。 最后，以 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ雙酶切 IGF-1 拷貝數(shù)分別為一至四的克隆載體，以EcoR Ⅰ酶切 pMD-Pie-GFP，回收 IGF-1(1-4)- SV40 polyA 和 Pie-GFP，將這兩段基因插到已有的柞蠶核型多角體病毒轉(zhuǎn)移載體pApM的多克隆位點(diǎn)上，其中IGF-1 在 pApM的多角體基因啟動(dòng)子下游，Pie-GF