豬霍亂沙門氏菌攜帶的含APP apxIIA基因的雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pEPR-apxIIA的構(gòu)建.pdf

1、豬霍亂沙門氏菌C500株不僅可以作為預(yù)防豬沙門氏菌病的活疫苗，還可作為載體運(yùn)送其他DNA疫苗，并通過(guò)口服免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的各種免疫應(yīng)答。本研究將rrnbT1T2轉(zhuǎn)錄終止序列插入真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1的多克隆位點(diǎn)MCS下游，構(gòu)建成pEGFP-rrnBT1T2。然后根據(jù)原核啟動(dòng)子Ptrc結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并人工合成該雜合啟動(dòng)子，將其置于pEGFP-rrnBT1T2的真核啟動(dòng)子CMVIE下游，構(gòu)建成雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pEGFPPtrcR，用

2、1×TSS法轉(zhuǎn)化已經(jīng)鑒定好的豬霍亂沙門氏菌C500株，得到工程菌C500/pEGFPPtrcR，該菌的保持了C500原有的生長(zhǎng)特性、生化特性及血清學(xué)特征，在體外至少能穩(wěn)定遺傳20代。為驗(yàn)證pEGFPPtrcR的有效性，檢測(cè)了報(bào)告基因EGFP在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)情況。在熒光顯微鏡下可觀察到單個(gè)工程菌C500/pEGFPPtrcR發(fā)出綠色熒光，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白約為27KD，與預(yù)期相符。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pEGFPPtrc

3、R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核Vero細(xì)胞24h后也觀察到綠色熒光。表明，能同時(shí)進(jìn)行原核和真核表達(dá)的雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pEGFPPtrcR構(gòu)建成功。預(yù)示雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pEGFPPtrcR攜帶的外源基因既可在沙門氏菌C500中表達(dá)，又可在體細(xì)胞中表達(dá)，抗原的表達(dá)量增加因而可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，在研制新型重組沙門氏菌疫苗方面有著誘人的應(yīng)用前景。 豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜

4、肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一種豬傳染性呼吸道疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防和控制該病的主要措施是疫苗免疫接種。參照GenBank中APP的apxⅡA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(apxⅡA 1和apxⅡA2)，以本實(shí)驗(yàn)室分離的APP-CYY株的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出apxⅡA全基因，測(cè)序結(jié)果顯示，apxⅡA基因全長(zhǎng)2871bp，與GenBank中其他5個(gè)

5、APP菌株的apxⅡA同源性高達(dá)99.5-99.9％。氨基酸序列分析，該基因編碼957個(gè)氨基酸，具有典型RTX毒素特征，無(wú)信號(hào)肽。將該基兇插入雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pEGFPPtrcR的MCS中，構(gòu)建成雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒pEPR-apxⅡA，用1×TSS法轉(zhuǎn)化豬霍亂沙門氏菌C500株，得到工程菌C500/pEPR-apxⅡA，該菌保持了C500原有的生長(zhǎng)特性、生化特性及血清學(xué)特征，在體外至少能穩(wěn)定遺傳20代。其在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，經(jīng)

6、SDS-PAGE檢測(cè)，EGFP與apxⅡA的融合表達(dá)蛋白約為130KD。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pEPR-apxⅡA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核 Vero 細(xì)胞細(xì)胞24h后也檢測(cè)到綠色熒光。證明，雙啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒pEPR-apxⅡA構(gòu)建成功，可在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)。為構(gòu)建以C500為載體的高效豬傳胸DNA活疫苗打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，進(jìn)而為研制豬傳染性胸膜肺炎和仔豬副傷寒二價(jià)疫苗的開辟了道路。 invA基因是沙門氏菌的侵襲蛋白，可通過(guò)同源重組的方式將其

7、缺失突變從而可能進(jìn)一步降低豬霍亂沙門氏菌C500的毒力。以C500基因組為模板，擴(kuò)增了C500 invA兩側(cè)基因invB和invE；以pEGFPPtrcR質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增了pTER，含有原核啟動(dòng)子Ptrc和EGPF。按照沙門氏菌基因組中invB-invA-invE基因的排列方向和順序，將它們連接入pUC18載體中，并通過(guò)酶切補(bǔ)平連接方式，除去了inB端的Hind Ⅲ和invE端的EcoRI酶切位點(diǎn)，保證pTER中MCS的使用完整性。構(gòu)建