表達(dá)腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛的減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌重組疫苗的構(gòu)建及免疫保護(hù)研究.pdf

1、沙門(mén)氏菌病(Salmonellosis)是由沙門(mén)氏菌引起的常見(jiàn)人畜共患病，除了初生動(dòng)物，一般人畜感染后呈現(xiàn)無(wú)癥狀的帶菌狀態(tài)，長(zhǎng)期排菌，造成養(yǎng)禽業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis，S.enteritidis)是引起沙門(mén)氏菌病和食物中毒的主要原因之一。日常生產(chǎn)中預(yù)防和控制腸炎沙門(mén)氏菌的主要方法是抗生素治療，但是由于抗生素的不合理使用，所產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題和藥物殘留

2、問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注。因此，尋找一個(gè)安全有效的途徑來(lái)防治腸炎沙門(mén)氏菌是亟需解決的問(wèn)題。經(jīng)過(guò)不斷地探索發(fā)現(xiàn)，采用疫苗免疫結(jié)合合理用藥的方式是防治腸炎沙門(mén)氏菌感染較為有效的方法。因此，開(kāi)發(fā)出具有強(qiáng)保護(hù)力的廣譜的新型基因工程苗有著重要的意義。本研究通過(guò)使用以asd基因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)志基因的減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌SG9R染色體-質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)，表達(dá)腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛抗原，并評(píng)價(jià)該重組口服疫苗對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌病的免疫保護(hù)效果。
　　1.腸炎

3、沙門(mén)氏菌SEF14菌毛操縱子的克隆與表達(dá)
　　SEF14菌毛特異性表達(dá)于腸炎沙門(mén)氏菌及其相近的D-群沙門(mén)氏菌血清型中，在體外克隆和表達(dá)腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛操縱子sef結(jié)構(gòu)基因，并檢測(cè)重組菌毛的生物學(xué)活性。以表達(dá)腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛操縱子的腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株SD-2基因組DNA為模板，利用分步PCR擴(kuò)增出編碼SEF14菌毛操縱子的基因序列，將其克隆至表達(dá)載體pBR322，構(gòu)建和篩選出含sef完整基因并正確插入pBR322

4、的重組質(zhì)粒pBR322-sef。再將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至不含任何菌毛和鞭毛的大腸桿菌SE5000工程菌，并命名為psef。將pBR322空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至SE5000，構(gòu)建陰性對(duì)照菌，命名為p322。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌psef能與SEF14菌毛單克隆抗體發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，而不與p322發(fā)生任何可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。電鏡下可以觀察到重組菌psef菌體表面表達(dá)了菌毛，Western blot可得到分子量大約為14.3kDa的蛋白條帶，表明SEF14菌毛

5、已成功在SE5000表達(dá)。本研究為進(jìn)一步研究腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛生物學(xué)作用及開(kāi)發(fā)出以SEF14菌毛作為免疫原的基因工程苗奠定了基礎(chǔ)。
　　2.腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛操縱子主要亞單位sefA的克隆、原核表達(dá)與多克隆抗體的制備
　　根據(jù)Genbank發(fā)表的腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛操縱子主要結(jié)構(gòu)亞單位sefA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株SD-2基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增sefA基因片段，將PCR產(chǎn)物

6、按預(yù)定的閱讀框插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sefA，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)進(jìn)行高效誘導(dǎo)表達(dá)，得到大小約為14kDa的可溶性重組蛋白。經(jīng)過(guò)條件摸索，重組菌在IPTG濃度為0.2mM的條件下，25℃誘導(dǎo)5h時(shí)蛋白表達(dá)量最高。通過(guò)Ni-NTA親和層析獲得高純度的融合蛋白，將純化后的重組蛋白免疫小鼠，獲得高特異性的SEFA多抗血清，該多抗血清能識(shí)別腸炎沙門(mén)氏菌及重組原核表達(dá)

7、載體。本研究構(gòu)建、表達(dá)并獲得高純度的融合蛋白rSEFA，并成功獲得鼠源SEFA多抗血清，為進(jìn)一步探究構(gòu)建能表達(dá)SEF14菌毛抗原的重組基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　3.表達(dá)腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛的重組減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌的構(gòu)建及免疫保護(hù)效果研究
　　基于研究一構(gòu)建的具sef操縱子基因并能表達(dá)SEF14菌毛的psef重組質(zhì)粒，使用SalⅠ和NcoⅠ雙酶切將其插入含asd基因的表達(dá)載體pYA3342中，再轉(zhuǎn)化至減毒雞傷寒沙門(mén)氏菌

8、SG9R△asd突變株中，構(gòu)建出重組菌SG9R(pYA3342-sef);利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼表達(dá)SEF14菌毛的sefA主要結(jié)構(gòu)亞單位基因，以同樣的方法構(gòu)建出重組菌SG9R(pYA3342-sefA)。采用玻板凝集試驗(yàn)和Western blot驗(yàn)證重組菌菌毛的表達(dá)，并進(jìn)行雞巨噬細(xì)胞系HD11的吞噬試驗(yàn)和存活試驗(yàn)，分析兩組重組菌的生長(zhǎng)特性、遺傳穩(wěn)定性及口服安全性等生物學(xué)特性。細(xì)胞試驗(yàn)表明，HD11對(duì)SG9R(pYA3342-sef)

9、組吞噬數(shù)量少于SG9R(pYA3342-sefA)組和SG9R(pYA3342)組，該組菌在HD11中的存活能力也低于SG9R(pYA3342-sefA)組和SG9R(pYA3342)組，且差異均顯著（P＜0.05）。將35日齡非免疫清遠(yuǎn)麻雞口服接種重組菌，并在二周后進(jìn)行二免，其中SG9R(pYA3342-sef)、SG9R(pYA3342-sefA)為免疫組，SG9R(pYA3342)為空載體對(duì)照組，另設(shè)PBS空白對(duì)照組。免疫后每組每

10、周隨機(jī)取3只雞分離外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析外周血CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，SG9R(pYA3342-sef組CD3+、CD8+T細(xì)胞各時(shí)期含量均高于SG9R(pYA3342-sefA)組和SG9R(pYA3342)組和PBS對(duì)照組，且在二免兩周達(dá)到最高;分別采集各組雞每周的血清，利用間接ELISA檢測(cè)其體內(nèi)特異性IgG抗體的水平，結(jié)果顯示二免一周和二免兩周時(shí)SG9R(pYA3342-sef)組血清IgG抗體

11、水平顯著高于SG9R(pYA3342-sefA)組和SG9R(pYA3342)組和PBS對(duì)照組(P＜0.05）;二免兩周后收集氣管黏膜樣品和腸黏膜樣品，利用間接ELISA檢測(cè)特異性sIgA的水平，SG9R(pYA3342-sef)組十二指腸、空腸、盲腸和回腸sIgA抗體水平顯著高于SG9R(pYA3342-sefA)組和SG9R(pYA3342)組和PBS對(duì)照組(P＜0.05）;在二免兩周后對(duì)每組雞口服攻毒腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株SD-2，觀