腸炎沙門氏菌SEF14菌毛功能探索.pdf

1、鑒于目前臨床上無簡(jiǎn)單易行的腸炎沙門氏菌特異性檢測(cè)方法，根據(jù)SEF14菌毛特異性表達(dá)于腸炎沙門氏菌這一特點(diǎn)，本試驗(yàn)體外重組表達(dá)SEF14菌毛主要亞單位蛋白SEFA，并以此建立間接ELISA方法特異性檢測(cè)臨床腸炎沙門氏菌感染；構(gòu)建腸炎沙門氏菌SEF14菌毛亞單位突變株，通過動(dòng)物感染試驗(yàn)以及體外系列細(xì)胞試驗(yàn)揭示其在腸炎沙門氏菌致病過程中的一定作用，旨在闡述腸炎沙門氏菌的隱性帶菌感染相關(guān)性，借助構(gòu)建的突變株探索中國(guó)地方品種家禽與腸炎沙門氏菌的易

2、感性之間的關(guān)聯(lián)，試圖為家禽的抗病育種尋找新的線索。
　　 1、SEF14菌毛操縱子在腸炎沙門氏菌和相近D-群沙門氏菌中的變異
　　 本試驗(yàn)部分用PCR方法檢測(cè)了18株雞白痢沙門氏菌，11株腸炎沙門氏菌以及1株都柏林沙門氏菌株中SEF14菌毛操縱子亞單位基因sefA，sefD以及調(diào)控基因sefR存在與變異情況。結(jié)果表明：從11株腸炎沙門氏菌以及1株都柏林沙門氏菌染色體DNA中能成功擴(kuò)增sefA，sefD以及sefR基因；從

3、18株雞白痢沙門氏菌能成功擴(kuò)增sefA基因，但只有分離于1980年之前的7株分離菌能成功擴(kuò)增sefD和sefR基因，而另11株1980年后分離菌PCR擴(kuò)增卻無任何產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，11株腸炎沙門氏菌以及1株都柏林沙門氏菌株中sefA，sefD以及sefR基因和已發(fā)表的序列100％同源；分析比對(duì)分離于1980年之前的7株雞白痢沙門氏菌sefD基因測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在196位點(diǎn)發(fā)生堿基缺失，造成閱讀框移碼，在氨基酸71位點(diǎn)處產(chǎn)生終止

4、密碼子。優(yōu)化體外菌毛表達(dá)的培養(yǎng)條件，體外菌毛抽提和鑒定試驗(yàn)證明：腸炎沙門氏菌以及都柏林沙門氏菌體外能很好表達(dá)SEF14菌毛，但雞白痢沙門氏菌卻無任何表達(dá)跡象。SEF14菌毛操縱子結(jié)構(gòu)基因sefA，sefD以及調(diào)控基因sefR在不同沙門氏菌中的變異情況可能是SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌、都柏林沙門氏菌中特異性表達(dá)的原因之一。
　　 2、腸炎沙門氏菌SEF14菌毛主要亞單位sefA的克隆、表達(dá)以及免疫活性檢測(cè)
　　 據(jù)腸炎沙

5、門氏菌SEF14菌毛操縱子亞單位sefA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用PCR技術(shù)從國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株50336中擴(kuò)增sefA基因，并按預(yù)定的閱讀框插入表達(dá)性載體pET22b+中，獲得重組質(zhì)粒pETsefA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切消化結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳分析和序列測(cè)定結(jié)果表明，該序列大小為498bp，與已發(fā)表的sefA結(jié)構(gòu)編碼序列完全一致。重組質(zhì)粒pETsefA轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)并能獲得高效誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)菌體裂解上清液通過SDS-P

6、AGE和Western-blotting分析鑒定，該重組菌可以表達(dá)大小為15.2kD的可溶性重組蛋白rSEFA。純化rSEFA免疫小鼠得到的高免血清與標(biāo)準(zhǔn)株50336感染小鼠血清一樣，在Western-blotting中，均能識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)株腸炎沙門氏菌SEF14菌毛蛋白以及純化的重組蛋白rSEFA，說明體外表達(dá)的rSEFA蛋白有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，為后續(xù)建立腸炎沙門氏菌特異性檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)。
　　 3、腸炎沙門氏菌間接ELI

7、SA檢測(cè)方法的建立
　　 建立和優(yōu)化了重組蛋白rSEFA介導(dǎo)的間接ELISA方法特異性檢測(cè)腸炎沙門氏菌血清抗體。確定了其抗原最佳包被量為7.5μg/ml，血清最適稀釋度1∶100，作用時(shí)間為60min;酶標(biāo)二抗最適稀釋度為1∶4000，作用時(shí)間為60min;判定標(biāo)準(zhǔn)為OD值≥0.346，基于rSEFA介導(dǎo)的間接ELISA有較好的特異性，能特異性識(shí)別腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌感染血清，不能識(shí)別相近的雞白痢沙門氏菌感染血清，此方法

8、與菌體凝集反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)臨床隨機(jī)血清樣品100份，兩者陽性率分別為67％和54％，結(jié)果符合率為80.6％。這一方法的建立對(duì)腸炎沙門氏菌特異性抗體檢測(cè)有潛在的應(yīng)用前景，試劑盒的完善將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)相關(guān)研究的空白，為家禽種群腸炎沙門氏菌凈化工作以及日常血清篩查提供了極大的便利。
　　 4、基于Red同源重組和高效自殺性載體系統(tǒng)構(gòu)建腸炎沙門氏菌SEF14菌毛亞單位突變株
　　 Red同源重組系統(tǒng)和高效自殺性載體系統(tǒng)都能對(duì)革蘭氏陰性菌染

9、色體直接進(jìn)行修飾，本試驗(yàn)利用上述兩種系統(tǒng)敲除4株不同來源腸炎沙門氏菌(X)SEF14菌毛操縱子亞單位sffD或sefA基因，包括國(guó)際國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株，雞源以及人源臨床分離株，并對(duì)構(gòu)建腸炎沙門氏菌突變株方法進(jìn)行比較?；诤瑂efD基因同源臂片段和抗生素表達(dá)盒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用Red同源重組系統(tǒng)，電轉(zhuǎn)化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物至不同源腸炎沙門氏菌各菌株，通過同源臂發(fā)生同源重組交換缺失sefD基因，一步法構(gòu)建各菌株sefD基因突變株X△sefD∷Cat。

10、在二次重組中利用攜帶FLP位點(diǎn)特異性重組酶的溫度敏感性質(zhì)粒，去除上述突變株中的篩選用抗性基因標(biāo)志，獲sefD基因突變株X△sefD，結(jié)合PCR擴(kuò)增和序列鑒定，證明上述各突變株正確構(gòu)建。在高效自殺性載體系統(tǒng)中，根據(jù)sefA基因兩端的已知序列，PCR擴(kuò)增鄰近sefA基因左右兩側(cè)各1000bp大小的同源臂DNA片斷，然后將其克隆入自殺性載體質(zhì)粒pRE112中，將成功構(gòu)建的含同源臂DNA片斷的重組自殺質(zhì)粒pRE1122電轉(zhuǎn)化至不同源腸炎沙門氏菌

11、各菌株，重組質(zhì)粒和染色體DNA通過同源臂發(fā)生同源重組交換缺失sefA基因，自殺性載體質(zhì)粒含有sacB基因，在蔗糖存在時(shí)不能穩(wěn)定傳代，在二次重組中通過蔗糖培養(yǎng)基傳代篩選抗性敏感的sefA突變株，PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定sefA突變株的正確構(gòu)建。比較兩個(gè)系統(tǒng)在腸炎沙門氏菌基因缺失株構(gòu)建上的應(yīng)用：Red同源重組系統(tǒng)能將PCR產(chǎn)物一步法直接轉(zhuǎn)化腸炎沙門氏菌，在重組酶的作用下，通過較短同源臂發(fā)生同源重組交換，但對(duì)PCR產(chǎn)物和感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量要求很高，

12、一次重組效率很低，而二次重組過程中去除抗性選擇標(biāo)志則相對(duì)簡(jiǎn)單、高效。自殺性載體系統(tǒng)若將構(gòu)建好的含同源臂DNA片斷的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，其一次重組效率高，二次重組也只需蔗糖培養(yǎng)基中傳代丟失抗性質(zhì)粒。但Red同源重組系統(tǒng)將在染色體中殘留FRT位點(diǎn)；而自殺性載體系統(tǒng)在染色體中可不留任何痕跡。兩個(gè)系統(tǒng)都能對(duì)不同源腸炎沙門氏菌染色體進(jìn)行直接修飾，且易刪除抗性選擇標(biāo)志，但傳統(tǒng)的高效自殺性載體系統(tǒng)需構(gòu)建含同源臂的打靶質(zhì)粒，多次酶切連接，操作繁瑣，Re

13、d同源重組系統(tǒng)更方便快捷，省時(shí)省力?；赟EF14菌毛操縱子亞單位sefD、sefA和sefAsefD雙基因缺失株成功獲得，為進(jìn)一步深入研究腸炎沙門氏菌SEF14菌毛與機(jī)體相互作用的分子致病機(jī)理及對(duì)該病防制奠定了一定基礎(chǔ)。
　　 5、腸炎沙門氏菌和其SEF14菌毛突變株對(duì)Balb/c小鼠和中國(guó)地方品種雞的感染
　　 以腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株50336和突變株50336△sefA、50336△sefD和雙突變株50336△se

14、fA△sefD為生物材料，以腹腔注射和頸部皮下注射為感染途徑，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)株及突變株對(duì)6周齡Balb/c小鼠的半數(shù)致死量(LD50)以及上述菌株對(duì)中國(guó)地方品種雞-清遠(yuǎn)麻雞(1日齡)的感染情況，以探討SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌致病過程中的作用。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)株50336以及突變株50336△sefA、50336△sefD6周齡Balb/c小鼠的LD50分別為19.95 cfu，7.94 cfu，7.94cfu，說明SEF14菌毛不同亞單位蛋

15、白影響腸炎沙門氏菌對(duì)Balb/c小鼠的LD50，SEF14菌毛亞單位基因突變株50336△sefA和50336△sefD增強(qiáng)腸炎沙門氏菌對(duì)Balb/c小鼠毒力。對(duì)1日齡清遠(yuǎn)麻雞的感染結(jié)果顯示亞單位基因突變株50336△sefA和雙突變株50336△sefA△sefD感染力更強(qiáng)，與標(biāo)準(zhǔn)株50336感染組相比，其死亡率增高，并嚴(yán)重影響雛雞的增重。腸炎沙門氏菌以及相應(yīng)突變株感染小鼠和清遠(yuǎn)麻雞后，感染菌臟器分布廣泛，細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果表明，試驗(yàn)

16、期間在感染動(dòng)物臟器肝、腎、脾、肺、盲腸以及小腸中都能成功分離攻毒菌株。中國(guó)地方雞品種資源豐富，遺傳背景多樣，抗病能力差異較大，根據(jù)腸炎沙門氏菌以及相應(yīng)SEF14菌毛突變株對(duì)地方品種雞的感染試驗(yàn)，檢測(cè)清遠(yuǎn)麻雞對(duì)不同菌株的感染力，為中國(guó)地方品種雞的抗病育種提供線索。
　　 6、SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌致病過程中作用初探
　　 致病菌黏附于易感宿主細(xì)胞是成功感染的第一步，巨噬細(xì)胞在腸炎沙門氏菌感染中有著重要作用，腸炎沙門氏

17、菌入侵巨噬細(xì)胞并能在其中正常生長(zhǎng)繁殖，可能是腸炎沙門氏菌在感染宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存在并擴(kuò)散的原因之一。本試驗(yàn)基于上述構(gòu)建的突變株，分析比較4株腸炎沙門氏菌(X)和其對(duì)應(yīng)的SEF14菌毛亞單位基因突變株X△sefA、X△sefD以及雙突變株X△sefAsefD與腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2的黏附作用，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用和野生菌以及相應(yīng)突變株在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活作用。腸上皮細(xì)胞的黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，所有野生株及其相應(yīng)的突變株在1h和4h內(nèi)

18、都能很好的黏附上皮細(xì)胞，且隨著時(shí)間的增加，黏附數(shù)量增多，但此時(shí)間內(nèi)，野生株以及相應(yīng)突變株在黏附數(shù)量上差異不顯著。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)和存活試驗(yàn)結(jié)果表明：活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)相應(yīng)突變株X△sefA、X△sefD以及雙突變株X△sefA△sefD的吞噬作用加強(qiáng)，其在小鼠巨噬細(xì)胞中的存活能力提高，這一結(jié)果可能意味著SEF14菌毛并不特異性介導(dǎo)腸炎沙門氏菌與腸上皮細(xì)胞的粘附作用，或者不是粘附的主要作用因子，可能與其在巨噬細(xì)胞中的作用有關(guān)