沙門(mén)氏菌PEG菌毛單克隆抗體研制及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、沙門(mén)氏菌廣泛分布在自然界中，為革蘭氏陰性菌，是腸桿菌科屬中重要的人畜共患病原菌。目前已確認(rèn)的沙門(mén)氏菌血清型高達(dá)2600多種。在畜禽生產(chǎn)養(yǎng)殖中，沙門(mén)氏菌污染一直是不可忽視的問(wèn)題，其中腸炎沙門(mén)氏菌(S.enteritidis)和雞-雛沙門(mén)氏菌(S.gallinarum-pullorum)是禽類(lèi)養(yǎng)殖中沙門(mén)氏菌污染的常見(jiàn)血清型，可引起產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能下降、肉雞逐漸消瘦和雛雞大量死亡等危害，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本文研究D群沙門(mén)氏

2、菌中腸炎沙門(mén)氏菌和雞-雛沙門(mén)氏菌特異表達(dá)的PEG菌毛，通過(guò)PCR擴(kuò)增該菌毛主要亞單位pegA基因，構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)并制備PEG菌毛單克隆抗體，利用玻板凝集方法快速檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌和雞-雛沙門(mén)氏菌，為判斷禽沙門(mén)氏菌污染提供依據(jù)。本文分三部分進(jìn)行研究論述:
　　研究一:沙門(mén)氏菌PEG菌毛主要亞單位基因pegA的原核表達(dá)。根據(jù)GenBank中PEG菌毛的全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)菌毛主要亞單位pegA的特異性引物，以雞白痢沙門(mén)氏菌CVCC

3、526基因組為模板，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)大量獲得pegA目的基因?；蚱慰寺∪雙MD19-T載體，測(cè)序結(jié)果表明序列大小為531 bp，符合預(yù)計(jì)大小且序列未突變。為制備并純化重組蛋白，將pegA基因片段克隆入帶有HIS標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b(+)-pegA。將篩選好的重組質(zhì)粒pET-22b(+)-pegA轉(zhuǎn)化至E.coliB L21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得大小約為23 KDa的

4、可溶性蛋白。表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎳柱試劑盒純化后，獲得濃度約0.83 mg/mL的純化重組蛋白，命名為rPegA。通過(guò)SDS-PAGE和Western blot分析蛋白條帶大小和反應(yīng)特異性，確定制備的融合蛋白為預(yù)期目的蛋白。
　　研究二:抗沙門(mén)氏菌PEG菌毛單克隆抗體的制備。將表達(dá)的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，在細(xì)胞融合和三次亞克隆篩選后獲得3株穩(wěn)定分泌的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D10，3D12和4B

5、4。這三株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)液氮凍存后復(fù)蘇，連續(xù)傳代后效價(jià)未降低，穩(wěn)定性良好。間接ELISA方法測(cè)定單抗腹水效價(jià)3D12為1∶64000。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明制備的單克隆抗體均能特異性的與重組蛋白、腸炎沙門(mén)氏菌CMCC50336，雞白痢沙門(mén)氏菌CVCC526和雞傷寒沙門(mén)氏菌T63發(fā)生反應(yīng)，而與鼠傷寒沙門(mén)氏菌T14和大腸桿菌DH5α均不發(fā)生反應(yīng)。玻板凝集試驗(yàn)結(jié)果表明，單抗腹水可以與腸炎沙門(mén)氏菌50336，雞白痢沙門(mén)氏菌CVCC5

6、26和雞傷寒沙門(mén)氏菌T63凝集成陽(yáng)性反應(yīng)，而與鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌DH5α不產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。說(shuō)明本試驗(yàn)制備的PEG菌毛單克隆抗體具有良好的特異性。
　　研究三:沙門(mén)氏菌PEG菌毛單克隆抗體的初步臨床應(yīng)用。以PEG菌毛單克隆抗體建立玻板凝集方法，若玻板凝集試驗(yàn)呈陽(yáng)性，表明被檢菌液中含有腸炎沙門(mén)氏菌和/或雞-雛沙門(mén)氏菌，反之則無(wú)。PEG菌毛單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，玻板凝集方法檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的72份沙門(mén)氏菌樣本，共檢測(cè)出43份陽(yáng)