大鼠單克隆抗體平臺的初步建立及應用.pdf

1、大鼠-大鼠雜交瘤是繼小鼠雜交癌之后發(fā)展起來的另外一種單克隆抗體制備技術，其與小鼠雜交瘤技術相比，具有獨特的優(yōu)勢，如抗原識別譜廣、抗體產(chǎn)量高、可用于小鼠抗原的研究等，故其作為小鼠雜交瘤技術的良好補充，具有極大的科研價值和良好的應用前景。
　　 在小鼠單克隆抗體制備過程中，對于小鼠免疫效果的評價，目前采用的方式均為檢測免疫小鼠的抗血清滴度，其結果僅能夠反映小鼠常規(guī)免疫階段的體液免疫應答，而不能夠反映小鼠細胞免疫應答及最后一次加強免疫

2、（尾靜脈注射、脾免）的效果，但最后一次加強免疫對雜交瘤制備時的融合陽性率及后期所得單抗親和力性質等方面均有著至關重要的影響，因此，有必要對此種免疫評價方式加以完善。IFN-γ是主要由激活的T淋巴細胞分泌的一種細胞因子，研究表明，內源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機體的細胞免疫狀態(tài)，所以通過對小鼠脾細胞經(jīng)免疫原刺激后分泌IFN-γ水平的定量檢測，可以更加準確地評價小鼠的免疫效果。
　　 本研究從國外引進Lou/C大鼠鼠

3、種，并對大鼠免疫、細胞融合、細胞株克隆化、腹水生產(chǎn)及純化等一系列實驗條件進行摸索，成功建立基于大鼠-大鼠雜交瘤技術的大鼠單克隆抗體制備平臺，并利用該平臺制備了大鼠抗小鼠IFN-γ單克隆抗體，進而建立起定量檢測小鼠IFN-γ的雙抗夾心ELISA方法，用于小鼠細胞免疫效果的評價。
　　 首先，利用重組蛋白作為抗原，以不同的免疫方式（皮下注射、腹腔注射）對Lou/C大鼠進行常規(guī)免疫，通過抗血清滴度跟蹤檢測初步評價免疫效果進而確定免疫方

4、式；對大鼠淋巴瘤細胞系YB2/0進行Lou/C腹水誘導驗證，確定其可用于大鼠雜交瘤細胞制備，同時財其與大鼠脾細胞的融合條件進行一系列摸索，初步確定了最佳融合方案，保證細胞融合率；采用有限稀釋計數(shù)法對雜交瘤細胞進行連續(xù)克隆化得到穩(wěn)定雜交瘤細胞株，并嘗試進行Lou/C大鼠腹水誘導；摸索并確定從大鼠腹水中純化單抗的方法，對所得單抗進行初步評價，最終成功建立起完整的大鼠單克隆抗體制備平臺。
　　 其次，采用RT-PCR方法從小鼠脾臟細胞

5、中擴增出小鼠IFN-γ全長cDNA序列，以該產(chǎn)物為模板，進一步PCR得到編碼小鼠IFN-γ成熟蛋白的DNA片段，將其亞克隆至原核表達載體pET-22b+上，轉化大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達并利用離子交換層析純化得到純度＞90％的目的蛋白。用商品化的mIFN-γELISA檢測試劑盒對目的蛋白進行檢測，結果顯示目的蛋白與單抗具有良好的反應性，可作為免疫原用于大鼠免疫及抗體制備。
　　 最后，利用重組表達mIFN-γ免疫Lou/

6、C大鼠，制備得到5株大鼠單抗，并進行HRP標記；利用方正滴定法篩選出可用于mIFN-γ檢測的最佳單抗配對8H7/14C9-HRP，建立mIFN-γ雙抗夾心ELISA定量檢測方法；用該方法對mIFN-γ標準品進行檢測，繪制標準曲線，結果顯示其線性范圍為6400～200pg/ml(R2=0.986)，檢測靈敏度為200pg/ml;與同類商品化試劑盒同時檢測mIFN-γ重組蛋白，結果顯示二者靈敏度相當，檢測結果無顯著差異。
　　 總之