攜帶TGEVS和PEDVS雙基因的減毒沙門氏菌在豬體的免疫動(dòng)態(tài)規(guī)律.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)均屬冠狀病毒屬，引起豬的高度接觸性腸道傳染病，給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，且目前沒有有效的藥物預(yù)防，疫苗是防控這兩種病的最佳選擇。本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建了攜帶TGEV S和PEDV S的雙基因疫苗SL7207(pVAXD-PS1-TS)和單基因疫苗SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)，并在小鼠模型上進(jìn)行了SL7207(pVAXD-PS1-TS)的免疫

2、評(píng)價(jià)。為了進(jìn)一步了解SL7207(pVAXD-PS1-TS)在豬體的免疫原性與動(dòng)態(tài)規(guī)律，我們將該雙基因口服疫苗在豬體進(jìn)行了免疫評(píng)價(jià)，對(duì)體液免疫、粘膜免疫、細(xì)胞因子、中和試驗(yàn)等進(jìn)行了全面的評(píng)價(jià)，為科學(xué)評(píng)價(jià)該疫苗提供依據(jù)，為后續(xù)研究提供參考。
　　將保存的疫苗菌株SL7207（pVAXD-PS1-TS）、SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)復(fù)蘇培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒對(duì)目的基因進(jìn)行PCR和酶切鑒定，結(jié)果證實(shí)攜帶質(zhì)

3、粒的準(zhǔn)確性，然后將菌株擴(kuò)大培養(yǎng)制備口服疫苗。將15頭仔豬隨機(jī)分成5組，雙基因免疫組SL7207(pVAXD-PS1-TS)、單基因?qū)φ战MSL7207(pVAXD-PS1)和L7207(pVAXD-TS)、空載體對(duì)照組SL7207(pVAXD)、含5％NaHCO3的PBS。將重組沙門氏菌以1.6×1011CFU的劑量分別口服接種3只仔豬，每頭豬口服10mL，兩周后以2.0×1011CFU的免疫劑量加強(qiáng)免疫，免疫后無臨床可見病變。分別在首次

4、免疫后第0、2、4、6、8w采集仔豬血液和糞黏液樣品，以ELISA檢測血清IgG、γ-干擾素、IL-4、糞便黏膜IgA抗體的動(dòng)態(tài)水平，以中和試驗(yàn)測定抗體中和效價(jià)，以MTT法檢測外周血淋巴細(xì)胞增殖情況。
　　體液免疫和黏膜免疫結(jié)果顯示:免疫組SL7207（pVAXD-PS1-TS）對(duì)照組SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的血清IgG抗體及糞黏液IgA抗體，SL7207(pVAX

5、D-PS1-TS)能同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)TGEV和PEDV的特異性抗體。首免后第2w，免疫組SL7207(pVAXD-PS1-TS)和對(duì)照組SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)特異性抗體開始增加，第4周均可檢測到特異性IgG、 IgA抗體;第6w抗體水平均達(dá)到最高峰，第8w抗體水平開始下降。中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SL7207(pVAXD-PS1-TS)、SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-T

6、S)均可誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生，其中SL7207(pVAXD-PS1-TS)組的PEDV中和效價(jià)10-1.57(1∶37.17)略低于SL7207(pVAXD-PS1)中抗PEDV中和效價(jià)可達(dá)10-1.7(1∶50.25); SL7207(pVAXD-PS1-TS)中誘導(dǎo)的抗TGEV中和效價(jià)10-1.5(1∶31.64)略低于SL7207(pVAXD-TS)誘導(dǎo)的抗TGEV中和抗體效價(jià)10-1.58(1∶38.02)。
　　細(xì)胞免疫結(jié)果

7、顯示:免疫組SL7207（pVAXD-PS1-TS）對(duì)照組SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)仔豬血清中都能檢測到IFN-γ和IL-4。第6周達(dá)到最高峰，且SL7207(pVAXD-TS-PS1)、SL7207（pVAXD-TS）、SL7207（pVAXD-PS1）組誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、 IL-4含量與SL7207(pVAXD)和PBS之間存在極顯著差異(P＜0.01);SL7207(pVAXD-PS1

8、-TS)誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4含量與SL7207(pVAXD-PS1)相比，具有顯著差異(P＜0.05)。外周血T淋巴細(xì)胞的增殖結(jié)果顯示:菌株SL7207(pVAXD-PS1-TS)、SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pV XD-TS)均可促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞的增殖。首免后第2w，外周血T淋巴細(xì)胞的增殖作用開始增強(qiáng);第6w，外周血T淋巴細(xì)胞的增殖作用均達(dá)到最高峰，與對(duì)照組SL7207(pVAXD)、PBS間存在極

9、顯著差異(P＜0.01)。且SL7207(pVAXD-PS1-TS)的增殖作用大于SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)。因此，SL7207(pVAXD-PS1-TS)在增強(qiáng)宿主特異性細(xì)胞免疫方面比單基因疫苗更具優(yōu)勢(shì)。
　　綜上所述，口服疫苗SL7207(pVAXD-PS1-TS)在豬體具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)全面的免疫反應(yīng)包括體液、黏膜、細(xì)胞免疫。該疫苗的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在它可以同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)TGEV