幽門螺桿菌CagA-UreB口服減毒沙門氏菌活載體疫苗的研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hpylori，Hp)廣泛存在于人類的胃中，是導致慢性胃炎、胃腸潰瘍、胃腺癌等胃腸疾病的主要病原菌，已嚴重影響著人們的身體健康。盡管國內(nèi)外采用抗生素三聯(lián)、四聯(lián)療法在治療Hpylori引起相關(guān)的胃炎和胃潰瘍等胃腸疾病方面取得了較大成果，但臨床發(fā)現(xiàn)廣譜抗生素的治療導致幽門螺桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)和治愈后復發(fā)率居高不下，臨床上將很快進入“感染-治愈-復發(fā)-再治療-耐藥”的惡性循環(huán)，不能徹底解決問

2、題。因此希望通過疫苗免疫奶牛使在牛奶中產(chǎn)生高水平的抗幽門螺桿菌抗體，通過口服該抗體，來預防和治療H.pylori引起的慢性胃炎、胃腸潰瘍等胃腸疾病。因此希望使用安全、高效、使用方便的疫苗來免疫動物產(chǎn)生高濃度抗體或用該疫苗免疫動物使之對幽門螺桿菌產(chǎn)生有效的抵抗力。
　　本研究首先選取生產(chǎn)后10天健康、無乳腺疾病和生殖器官疾病、體溫正常的奶牛14頭，隨機分為兩組:PBS對照組和幽門螺桿菌全菌蛋白免疫注射組，每組7頭。用濃度為2×101

3、0cfu/mL的幽門螺桿菌(H.polyri)NCTC11637全菌經(jīng)超聲破碎后與等劑量的完全（不完全）弗氏佐劑充分乳化后分別于0、14、28天三次多點肌肉注射全菌蛋白疫苗，每次4mL，免疫產(chǎn)后泌乳的健康奶牛，對照組每次注射PBS與弗氏佐劑乳化物4mL。每周采血和收集牛奶各一次，離心收集血清，以酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清、乳汁的IgG抗體，同時測量體溫，觀察發(fā)情和采食泌乳等健康情況。研究結(jié)果顯示經(jīng)肌注幽門螺桿菌全菌蛋白免疫奶牛后可在血清和

4、乳汁中產(chǎn)生特異性抗體，抗體濃度顯著高于對照組(P≤0.05)，但免疫結(jié)束后不久逐漸下降。免疫奶牛的體溫、發(fā)情和采食泌乳等情況正常。但全菌蛋白疫苗費用高，制作麻煩，注射時阻力大、奶牛反應(yīng)強烈，且需要多次多點注射。結(jié)果表明肌肉注射幽門螺桿菌全菌蛋白疫苗是一個安全、有效的免疫途徑。但全菌蛋白疫苗制作麻煩，費用高，注射時奶牛反應(yīng)大。
　　因此希望構(gòu)建更加安全、高效和使用更為方便的疫苗代替幽門螺桿菌全菌蛋白疫苗?？紤]到幽門螺桿菌是腸道菌群，

5、通過口服引起胃腸道粘膜免疫是一種可行途徑。但口服的蛋白疫苗的制作復雜，提純麻煩，且時間較長，同時需加相應(yīng)的免疫佐劑提高免疫原性，在口服過程中蛋白疫苗還容易被胃酸及胃蛋白酶破壞而喪失免疫功能。因此考慮用大腸桿菌或減毒沙門氏菌來作為載體。本實驗室多次采用減毒豬霍亂沙門氏菌C500作為載體，安全且免疫效果好，希望構(gòu)建幽門螺桿菌的減毒豬霍亂沙門菌C500口服活載體疫苗。
　　本實驗選取幽門螺桿菌中已證實具有免疫原性的兩個基因:尿素酶B(u

6、reaseB，UreB)和細胞毒素相關(guān)抗原(cytotoxin-associatedantigen，CagA)。先采用PCR技術(shù)從幽門螺桿菌標準株SS1擴增Hp-UreB和Hp-CagA基因，將其連接至原核表達質(zhì)粒pYA3493中，使之構(gòu)建為pYA3493-UreB-CagA重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR及酶切鑒定后測定其基因序列，并與GenBank中已發(fā)表的相關(guān)序列的進行同源性分析。重組質(zhì)粒pYA3493-UreB-CagA電擊轉(zhuǎn)入減毒豬霍亂沙門

7、菌C500，培養(yǎng)后篩選陽性菌落，抽提質(zhì)粒進行PCR及酶切鑒定。表達的UreB-CagA蛋白用SDS-PAGE和WesternBlotting進行鑒定。然后將無特定病原菌昆明小鼠分成5組，每組10只，分別為肌肉注射幽門螺桿菌全菌蛋白疫苗和灌胃分別給予含質(zhì)粒pYA3493-UreB-CagA的減毒沙門氏菌C500(0.2mL，1×1010CFUmL-1)、含空質(zhì)粒pYA3493的減毒沙門氏菌C500(0.2mL，1×1010CFUmL-1)

8、、減毒沙門氏菌C500(0.2mL，1×1010CFUmL-1)以及PBS(0.2mL)。每周免疫一次，連續(xù)五次。第六周后再用活HpyloriSS1(0.2mL，1×1010CFUmL-1)灌胃攻擊，每天一次，連續(xù)三天。第九周采血后處死實驗小鼠，取一半胃粘膜和十二指腸研磨進行細菌培養(yǎng)檢查月.pylori在胃腸定植情況，另一半用于組織切片和免疫組化觀察胃腸損傷情況和免疫蛋白分泌的情況，同時對重要臟器肝、脾、肺進行組織切片觀察損傷情況。實驗

9、前和實驗后每隔一周或二周采血一次，連續(xù)8次，離心分離血清，采用ELISA檢測小鼠血清中的抗體水平。檢驗pYA3493-UreB-CagA減毒豬霍亂沙門菌C500口服疫苗對小鼠的免疫效果和口服疫苗的安全性評價。結(jié)果:核苷酸序列測定及同源性分析證實，克隆的Hp-CagA和Hp-UreB基因與GenBank中相關(guān)序列的同源性分別為98％和100％(472/480和1134/1134)。重組質(zhì)粒pYA3493-UreB-CagA轉(zhuǎn)染減毒豬霍亂沙

10、門菌C500，可表達約59kD的UreB-CagA蛋白。全菌蛋白注射組和含質(zhì)粒pYA3493-UreB-CagA的減毒沙門氏菌C500組的血清中幽門螺桿菌特異抗體滴度顯著高于含質(zhì)粒pYA3493的減毒沙門氏菌C500組、減毒沙門氏菌C500組以及PBS組(P＜0.01)。但均未完全保護HpyloriSS1對胃的攻擊，五組中胃和十二指腸均有H.pyloriSS1的定植。但全菌蛋白注射組和含質(zhì)粒pYA3493-UreB-CagA的減毒沙門氏

11、菌C500組小鼠胃腸內(nèi)的菌落數(shù)量顯著低于含質(zhì)粒pYA3493的減毒沙門氏菌C500組、減毒沙門氏菌C500組以及PBS組(P＜0.01)。免疫組化表明全菌注射組和口服疫苗中胃和十二指腸有明顯的抗體存在，且所有組胃、十二指腸、肝、脾以及肺均無明顯損傷，也無小鼠死亡。結(jié)果表明建立了同時表達Hp-CagA和Hp-UreB基因的減毒豬霍亂沙門菌疫苗株，該口服減毒沙門氏菌載體疫苗有明顯的免疫預防效果，而且比較安全，但不能完全抑制幽門螺桿菌在胃和十

12、二指腸中定植。
　　以上是UreB-CagA雙價口服活載體疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫效果，安全有效。體外實驗希望通過構(gòu)建H.pylori的CagA和UreB基因重組真核表達質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)染到胃粘膜上皮細胞GES-1后，用幽門螺桿菌SS1攻擊轉(zhuǎn)染成功的胃上皮細胞GES-1，觀察對細胞凋亡及細胞形態(tài)的影響，探討細胞凋亡機制。
　　采用PCR技術(shù)從幽門螺桿菌標準株SS1中獲取CagA部分基因和UreB全長基兇與真核表達載體pEGFP-N

13、1相連，構(gòu)建幽門螺桿菌CagA/UreB真核熒光表達載體pEGFP-N1-CagA-UreB，并用脂質(zhì)體的方法將質(zhì)粒pEGFP-N1-UreB-CagA和空質(zhì)粒pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染到胃粘膜上皮細胞GES-1中，用G418篩選陽性細胞，用幽門螺桿菌SS1分別處理轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CagA-UreB的細胞、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細胞以及沒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞。用AnnexinV-APC和7-AAD染色后，流式細胞術(shù)檢測胃上皮細胞GES-1

14、凋亡和死亡的情況，同時透射電鏡觀察胃上皮細胞GES-1的形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒到細胞GES-1，轉(zhuǎn)染效率可高達60％以上，500μgG418可對轉(zhuǎn)染細胞進行篩選，篩選后的陽性細胞用幽門螺桿菌處理后，凋亡率要小于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞，但長時間處理后GES-1細胞均死亡，電鏡結(jié)果顯示細胞凋亡和壞死。結(jié)果表明質(zhì)粒pEGFP-N1-UreB-CagA可轉(zhuǎn)染到胃上皮細胞GES-1在培養(yǎng)細胞內(nèi)的表達可抵抗幽門螺桿菌SS1對