減毒鼠傷寒沙門菌為載體的幽門螺桿菌治療性疫苗實驗研究.pdf

1、幽門螺桿菌(H.pylori)是一種定植于人胃和十二指腸粘膜的螺旋形革蘭陰性菌，主要導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌。目前臨床治療H.pylori感染的方案，多采用包括兩種抗生素和一種質(zhì)子泵抑制劑的“三聯(lián)療法”，在一定程度上能清除H.pylori感染并治愈潰瘍。雖然抗生素在短期內(nèi)具有較好的根除療效，但抗生素的濫用已導(dǎo)致H.pylori耐藥率逐年上升。H.pylori高耐藥性是導(dǎo)致根除治療失敗的最主要原因，長此以往，可能出現(xiàn)H.pylori

2、感染無藥可治的嚴(yán)重后果。此外，抗生素療法還存在治療后易復(fù)發(fā)、可再感染和腸道菌群微生態(tài)失衡等不足，大大限制了其使用。在臨床上H.pylori高耐藥性的條件下，新抗生素因其研發(fā)周期長難以滿足臨床用藥需求，因此，尋求非抗生素的替代療法已迫在眉睫。
　　目前，國際上針對H.pylori感染已廣泛開展免疫治療研究，動物和人體試驗結(jié)果表明，免疫治療具有清除H.pylori的效果，提示治療性疫苗有希望成為治療或輔助抗生素治療H.pylori感染

3、的方法。H.pylori全菌疫苗(包括滅活全菌和全菌裂解物為抗原的疫苗)非常有效。然而，這種以全菌組分作為抗原的疫苗方式有著嚴(yán)重的局限性，比如菌體中LPS和Lewis抗原可能導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病等嚴(yán)重后果。以重組亞單位為抗原的疫苗和表位疫苗都表現(xiàn)出較好的抗H.pylori作用。目前已經(jīng)確定了一些H.pylori保護(hù)性抗原(如UreB、CagA和VacA等)，已作為候選抗原用于開發(fā)H.pylori疫苗。
　　自然

4、感染H.pylor后，引起Th1細(xì)胞活化，導(dǎo)致胃粘膜發(fā)生炎癥損傷甚至潰瘍。機體通過Treg細(xì)胞抑制胃粘膜過強的免疫應(yīng)答，這有利于胃粘膜炎癥損傷的修復(fù)，但同時使免疫系統(tǒng)對H.pylor處于免疫耐受狀態(tài)。CD4+T細(xì)胞在抗H.pylori保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要作用的觀點已被廣泛接受，大多數(shù)研究表明：高水平Th1偏向應(yīng)答是保護(hù)性免疫和清除H.pylori感染必需的。治療性疫苗要立足于打破機體對H.pylor的免疫耐受，誘導(dǎo)以Th1為主的CD4細(xì)

5、胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高水平IFN-γ等細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞等天然免疫，同時誘導(dǎo)粘膜sIgA應(yīng)答，發(fā)揮清除H.pylori感染和預(yù)防再感染的作用。口服沙門菌載體疫苗可以誘導(dǎo)典型的Th1型應(yīng)答，同時還能誘導(dǎo)顯著的粘膜sIgA產(chǎn)生。此外，沙門菌還可以通過微皺細(xì)胞(microfold cell，M細(xì)胞)的轉(zhuǎn)胞吞作用或通過樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)直接提呈抗原誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答。已有大量文獻(xiàn)報道，表達(dá)外源蛋白抗原的減毒沙門

6、菌活載體疫苗用于抗不同的病原體(包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲)感染，在動物模型實驗中均取得了良好的效果。
　　相關(guān)的研究表明，口服免疫重組沙門菌疫苗具有安全性好，免疫原性良好的特點。全長的H.pylori蛋白分子作為疫苗抗原含有非必要的抗原表位，而且分子量較大，難以表達(dá)和純化。而融合表位抗原易于表達(dá)和純化，融合蛋白疫苗是一種新的疫苗策略，可用于增強對多抗原組分的優(yōu)勢抗原表位的特異性免疫應(yīng)答。
　　【研究目的】
　　1．本研究

7、擬在H.pylori感染的小鼠模型體內(nèi)評價表達(dá)不同抗原表位融合蛋白的減毒沙門菌載體疫苗的治療效果。
　　2．初步明確Th1和Th2細(xì)胞應(yīng)答在疫苗免疫清除H.pylori感染中的作用?！狙芯糠椒ā?br>　　1．構(gòu)建表達(dá)H.pylori按不同順序排列的CagA、VacA和UreB抗原表位融合蛋白的減毒沙門菌載體疫苗，在H.pylori感染的小鼠模型體內(nèi)評價其療效。
　　2．Real-time PCR檢測免疫治療后小鼠胃內(nèi)H.p

8、ylori定植量改變，ELISA檢測血清、胃和小腸樣本中的特異性抗體水平變化，ELISA檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-4和IFN-γ表達(dá)量的差異。
　　【研究結(jié)果】
　　1．口服表達(dá)抗原表位融合蛋白CagA160-VacA62-UreB138(CVU)的減毒沙門菌免疫治療效果最好，清除率達(dá)62.5％，未清除小鼠胃內(nèi)H.pylori定植量與空質(zhì)粒菌組相比較顯著降低。
　　2．疫苗免疫后Th1應(yīng)答與未免疫組相比較顯著增強；疫苗免