減毒沙門氏菌為載體的CD40基因疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)性大腸癌生長(zhǎng)的影響.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分:重組大鼠CD40基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及功能鑒定
　　目的:構(gòu)建含pIRES2-EGFP-CD40基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　方法:從大鼠的脾臟組織中完整克隆出大鼠CD40基因全長(zhǎng)，成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，免疫雙熒光法檢測(cè)CD40的表達(dá)。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40并轉(zhuǎn)染COS

2、7細(xì)胞，證明真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40在COS7細(xì)胞中能夠穩(wěn)定表達(dá)目的基因。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了含pIRES2-EGFP-CD40基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　第二部分:含pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒減毒沙門氏菌的構(gòu)建及功能鑒定
　　目的:構(gòu)建含pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒的減毒沙門氏菌菌疫苗。
　　方法:采用電轉(zhuǎn)化法將pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門氏菌(L

3、B5000)，經(jīng)過(guò)甲基化修飾后的pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入終宿主菌SL3261，通過(guò)抗生素篩選法挑取單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)增，最終抽提質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定。
　　結(jié)果:終宿主菌SL3261在電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒后，通過(guò)質(zhì)粒抽提和FCR鑒定證實(shí)，其所獲得的目的條帶與原轉(zhuǎn)化質(zhì)粒條帶大小相同。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了能攜帶大鼠CD40基因真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CD40的SL32

4、61疫苗菌。
　　第三部分:含pIRES2-EGFP-CD40質(zhì)粒減毒沙門氏菌對(duì)大鼠大腸癌生長(zhǎng)的影響
　　目的:探討減毒沙門氏菌為載體的CD40基因疫苗對(duì)荷瘤大鼠免疫系統(tǒng)的影響及治療大腸癌可行性。
　　方法:雄性6-8周齡SD大鼠18只隨機(jī)分為3組，分別為SL3261組、空質(zhì)粒（pIRES2-EGFP）組以及CD40（pIRES2-EGFP-CD40）組。對(duì)全部大鼠應(yīng)用1，2-二甲肼連續(xù)皮下注射18周以構(gòu)建大鼠大腸癌實(shí)

5、驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分別于第8周、第10周、第12周及第16周根據(jù)所分組別不同共四次灌服SL3261、pIRES2-EGFP/SL3261和pIRES2-EGFP-CD40/SL3261，于18周后處死全部實(shí)驗(yàn)大鼠，將大鼠瘤體解剖后觀察并記錄瘤體大小、瘤體數(shù)量、有無(wú)轉(zhuǎn)移灶等，根據(jù)觀察指標(biāo)進(jìn)行Dukes分期;流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血和脾臟細(xì)胞表型，PHA刺激脾臟細(xì)胞72小時(shí)后培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量通過(guò)ELISA法檢測(cè)，脾臟細(xì)胞中GFP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)通過(guò)R

6、T-PCR進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:CD40組平均成瘤數(shù)為5.8±2.2個(gè)，明顯低于SL3261組的12.7±3.1和空質(zhì)粒組的11.6±2.4（P＜0.05)，空質(zhì)粒組和SL3261組兩組的成瘤數(shù)相比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;脾臟細(xì)胞和外周血表型檢測(cè)顯示CD40組的活化T細(xì)胞CD3+CD8+數(shù)量較其它荷瘤組明顯增高(P＜0.05)，PHA刺激脾細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)空質(zhì)粒組和SL3261組分泌IFN-γ的能力也明顯低于CD40組