減毒大腸桿菌作為口服疫苗投遞載體的研究.pdf

1、腸致病性大腸桿菌(E.coli)引起的仔豬腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。主要表現(xiàn)為嚴重的腹瀉、脫水，并導致大批仔豬死亡，嚴重影響仔豬的成活率。由于E.coli耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，導致藥物治療的效果越來越差，因此研制有效預防仔豬大腸桿菌性腹瀉的疫苗對預防該病的發(fā)生具有重要的實際意義。
　　腸致病性E.coli的流行情況復雜，其攜帶的毒力因子在不同的國家或地區(qū)的流行情況不同，即使在同一地區(qū)，毒力因子在不同年份的流行情況也有差別。本研

2、究旨在對近年腸致病性E.coli毒力基因分布進行調(diào)查，為疫苗抗原基因的選擇提供依據(jù);根據(jù)仔豬大腸桿菌性腹瀉的感染特點，探索以減毒大腸桿菌作為口服疫苗投遞載體的可行性。
　　本研究從38個規(guī)?；i場采集了290份糞便樣品，從中分離得到了381株E.coli。對E.coli分離株進行了毒力因子菌毛(K88、K99、987P、F41、F18、F17)、非菌毛黏附因子(AIDA-Ⅰ、paa、CS31A、eae、saa)、腸毒素（LT-Ⅰ、

3、LT-Ⅱ、STa、STb、EAST1）、志賀毒素(Stx1、Stx2、Stx2e)、毒力島(HPI、LEE)、α-溶血素(hlyA)、afa8基因簇(afaD、afaE)及sepA基因的PCR檢測。結(jié)果顯示，在381株E.coli中，有206株攜帶至少一個毒力基因。這些毒力基因的檢出結(jié)果分別為EAST1(n=120)、irp2(n=59)、paa(n=50)、STb(n=41)、AIDA-Ⅰ(n=34)、 LT-Ⅰ(n=23)、ler(

4、n=11)、hlyA(n=9)、K88(n=8)、eae(n=8)、STa(n=7)、sepA(n=6）、F18(n=5)、afaD(n=3)、afaE(n=3)、K99(n=2)及Stx2e(n=1)，而且，大多數(shù)菌株同時攜帶多個毒力因子。在檢測的毒力基因中，EAST1(58％)、irp2(29％)、AIDA-Ⅰ(16.5％)、paa(24％)及STb(20％)的檢出率較高，黏附因子的檢出率較低，在206株攜帶毒力基因的E.coli中

5、，超過半數(shù)的菌株不攜帶任何黏附因子。
　　仔豬大腸桿菌性腹瀉主要是以消化道為感染途經(jīng)，因此，口服疫苗免疫更接近自然感染過程。本研究用G-DOC及λRed同源重組系統(tǒng)敲除了野生E.coli O142中的STa基因，構(gòu)建了減毒E.coli O142:△STa，選擇其假基因yaiT為抗原基因插入位點，建立分別以Kil基因和mKate2基因為篩選標記的雙向篩選平臺。在此基礎(chǔ)上，用同源重組技術(shù)分別構(gòu)建表達嵌合類毒素LT192-STa13及L

6、T192-STb的重組大腸桿菌ER-A和ER-B，并對其腸毒性、消化環(huán)境生存能力、口服安全性、生長能力、遺傳穩(wěn)定性、菌毛生長能力、腸道定植能力進行了檢測，評估了這兩株重組E.coli作為口服疫苗的免疫效果。重組菌主要生物學特性研究結(jié)果顯示，重組菌ER-A及ER-B不具有腸毒性;在pH2.5和pH3.5的胃液中均能保持較高的存活率，在模擬腸液中可生長，在0.05％的膽汁酸鹽環(huán)境中生長良好;分別以109CFU和1010CFU的ER-A和ER

7、-B口服免疫小鼠，小鼠的日采食量和精神況與對照組小鼠無明顯差異，安全性良好;ER-A及ER-B與初始菌E.coli O142及毒素基因敲除的E.coli O142:△STa的生長曲線幾乎一致，說明STa毒素基因的敲除和類毒素基因的插入對菌體的生長代謝沒有造成影響;ER-A及ER-B在連續(xù)100次傳代后，插入的LT192-STa13和LT192-STb操縱子未見丟失，具有良好的遺傳穩(wěn)定性;ER-A及ER-B的菌體表明可正常的長出菌毛，說明

8、STa毒素基因的敲除和類毒素基因的插入未影響菌毛的生長;ER-A及ER-B可在小鼠腸道內(nèi)長時間存活，說明其具有良好的腸道定植能力。
　　重組菌ER-A及ER-B對BALB/c小鼠口服免疫效果檢測結(jié)果顯示，ER-A免疫組（A組）、ER-B免疫組（B組）、混合免疫組（M組）小鼠在首次免疫后的7～21d，在其血清中均可檢測到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.

9、05)的IgG抗體，首次免疫后第42d，小鼠乳汁、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸黏液中幾乎都能檢測到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgG抗體;各免疫組的小鼠在首次免疫后的7～28d，在其糞便中均可檢測到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體，首次免疫后第42d，

10、小鼠乳汁、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸黏液中幾乎都能檢測到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體。與對照組脾細胞和腸系膜淋巴細胞增殖效果相比，A、B和M免疫組都具有更強的刺激增殖效果(P＜0.05)，脾細胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值與對照組相比差異不明顯，而腸系膜淋巴細胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值小于1，發(fā)生了

11、顯著的平衡漂移，與對照組相比差異明顯，說明本研究對小鼠的口服免疫沒有能夠刺激小鼠全身的Th型細胞免疫應(yīng)答，但刺激小鼠產(chǎn)生了局部黏膜的Th2類細胞免疫反應(yīng)。A、B和M組小鼠的血清、腸粘液、脾細胞裂解液、腸系膜淋巴細胞裂解液可對腸毒素產(chǎn)生明顯的中和效果。
　　重組菌ER-A及ER-B對豬口服免疫效果檢測結(jié)果顯示，ER-A及ER-B可在豬腸道內(nèi)長時間存活，有良好的腸道定植能力。ER-A免疫組（A組）、ER-B免疫組（B組）、混合免疫組（

12、M組）豬在首次免疫后的7～28d，在其血清中均可檢測到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgG抗體，首次免疫后第42d，豬的乳汁、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸黏液中幾乎都能檢測到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgG抗體;A、B和M組豬在首次免疫后的14～28d，在其

13、糞便中均可檢測到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體，首次免疫后第42d，小鼠乳汁、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸黏液中幾乎都能檢測到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體。與對照組脾細胞、腸系膜淋巴細胞及血液淋巴細胞的增殖效果相比，A、B和M組都具有更強的

14、刺激增殖效果(P＜0.05)?；罹庖呓M的脾細胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值與對照組相比差異不顯著，而腸系膜淋巴細胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值小于1，發(fā)生了顯著的平衡漂移，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，說明本研究對仔豬的口服免疫沒有能夠刺激仔豬全身的Th型細胞免疫應(yīng)答，但刺激仔豬產(chǎn)生了局部黏膜的Th2類細胞免疫反應(yīng)。A、B和M組仔豬的血清、腸粘液、脾細胞裂解液、腸系膜淋巴細胞裂解液可對腸毒素

15、產(chǎn)生明顯的中和效果。各免疫組的仔豬在攻毒后，其腸絨毛高度、隱窩深度、腸絨毛高度/隱窩深度比值與對照組相比，差異顯著(P＜0.05)。
　　本研究通過對豬源腸致病性E.coli毒力基因的調(diào)查，明確了當前主要流行的菌株主要攜帶EAST1、irp2、AIDA-Ⅰ、paa和STb等毒力基因，很少攜帶黏附因子基因，為疫苗抗原基因的選擇提供了依據(jù);重組菌ER-A和ER-B對小鼠和豬的免疫效果檢測證明，口服疫苗可以誘導小鼠和豬良好的體液免疫和細