基于假基因內(nèi)插入的嵌合腸毒素重組減毒大腸桿菌口服疫苗候選菌株的研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是一種主要危害新生仔豬的急性傳染病，主要通過黏附素和腸毒素引起仔豬劇烈腹瀉。腹瀉的仔豬往往因沒得到有效預(yù)防而死亡，從而給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示:ETEC的耐藥性在不斷提高，而其黏附素的檢出率卻在下降，所以繼續(xù)使用傳統(tǒng)藥物以及針對(duì)黏附素的疫苗進(jìn)行防治已不合時(shí)宜，需要一種有效的疫苗盡快出現(xiàn)。
　　為明確嵌合基因在

2、具有天然佐劑功能的不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin-1，LT-1)骨架上的插入位置，先制備了一株針對(duì)LT-1，具有中和活性的特異性單克隆抗體，該單抗能有效的阻斷LT-1毒素與GM1受體的結(jié)合。通過生物信息學(xué)軟件ABCpred預(yù)測(cè)，然后用單抗對(duì)LTB進(jìn)行分段篩選，鑒定出與GM1受體結(jié)合的肽段MBP-LTB-7(61QKKAIERMKDTLRITY76)。以此為依據(jù)，在不影響段肽MBP-LTB-7結(jié)構(gòu)的位置插入外

3、源基因。
　　本研究以大腸桿菌K12基因序列為參照，使用在線服務(wù)軟件ABCpred預(yù)測(cè)出6個(gè)可插入外源基因的假基因位置，分別是yaiT、yaiX、ygeO和ygeQ、wbbL、insN、eaeH+和ykgA。進(jìn)一步經(jīng)PCR鑒定發(fā)現(xiàn)我們分離并改造的野生E.coli O142:ΔSTa菌株中yaiT和yaiX兩個(gè)假基因位置可作為攜帶外源基因的插入點(diǎn)。
　　分別以假基因yaiT和yaiX為模板擴(kuò)增出假基因yaiT和yaiX的左右同

4、源臂，連入pDOC-K質(zhì)粒上，構(gòu)建PRPL-Kil雙向篩選平臺(tái)，然后將平臺(tái)質(zhì)粒與pACBSCE質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化減毒E.coliO142∶ΔSTa中。經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)使其中的pACBSCE質(zhì)粒表達(dá)Ⅰ-SceⅠ切割酶和Red重組酶，含有假基因yaiT和yaiX同源臂的PRPL-Kil操縱子分別被切下后與E.coli O142∶ΔSTa中的yaiT和yaiX假基因位置發(fā)生同源重組，構(gòu)建成O142（yaiT∷ PRPL-Kil）和O142（yaiX

5、∷ PRPL-Kil）兩株雙向篩選平臺(tái)。經(jīng)鑒定當(dāng)溫度升高到43C時(shí)平臺(tái)中溫敏開關(guān)打開，kil1基因可殺死菌體起到反向篩選效果，表明平臺(tái)具有相應(yīng)生物活性。
　　通過SOE-PCR構(gòu)建嵌合類毒素基因，先將致弱的STaA13Q連在致弱的LTR192G操縱子B亞基后端，再利用SOE-PCR的方法將STb和LT天然轉(zhuǎn)錄終止子連到LT192-STa13后，獲得LT192-STa13-STb操縱子。將LTA分為L(zhǎng)TA1和LTA2兩段，再將STa

6、1rSTb從LT192-STa13-STb上克隆下來，與LTA1相連獲得LTA1-(STa13-STb)，最后再將LTA2-LTB-STa13-STb與其進(jìn)行組裝獲嵌合基因LTA1-(STa-STb)-LTA2-LTB-(STa-STb)操縱子。在其兩端分別連上假基因yaiT和yaiX的左右同源臂，構(gòu)建pDOC-C同源重組系統(tǒng)，按照建立平臺(tái)時(shí)的方法，用LTA1-(STa-STb)-LTA2-LTB-(STa-STb)操縱子去替換插在不同

7、假基因位置上的雙向篩選平臺(tái)，得到重組E.coli ER-T和ER-X。
　　通過毒性檢測(cè)、消化道環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)、口服安全性檢測(cè)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、菌毛生長(zhǎng)能力鑒定、及腸道定植能力測(cè)定，結(jié)果顯示:重組E.coli ER-T和ER-X安全、穩(wěn)定，可在腸道定植。
　　進(jìn)一步以重組E.coli ER-T和ER-X對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行口服免疫，檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)小鼠特異性IgG及IgA抗體水平，結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組小鼠首次免疫后7-

8、21d，在其血清中均可檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgG抗體。各實(shí)驗(yàn)組小鼠免疫后7-28d在其糞便中可檢測(cè)出抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體。首次免疫后42d在小鼠乳汁、脾臟、腸黏液、腸系膜淋巴結(jié)中仍能檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB

9、(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgG和IgA抗體;在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組脾細(xì)胞經(jīng)STa毒素、LT192-STa13重組蛋白、STb毒素、LT192-STb重組蛋白、LT毒素刺激后增殖效果明顯好于對(duì)照組(P＜0.05);各組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4檢測(cè)結(jié)果顯示:免疫組小鼠IFN-γ水平有所上升但沒有IL-4上升明顯。體外中和實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)中和試驗(yàn)結(jié)果顯示:口

10、服免疫后的小鼠血清、脾細(xì)胞裂解液、腸粘液、腸系膜淋巴細(xì)胞裂解液對(duì)腸毒素具有中和作用。乳鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示:獲得母源抗體的乳鼠具有抵抗腸毒素侵襲的能力。
　　重組E.coli ER-T和ER-X免疫仔豬和妊娠母豬后進(jìn)行IgG及IgA抗體檢測(cè)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子檢測(cè)、體內(nèi)中和以及體外中和實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果的趨勢(shì)與小鼠基本相似。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，免疫組腸絨毛的各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)優(yōu)于對(duì)照組仔豬，兩者差異顯著(P＜0.05)，表明免疫后仔豬可以抵