豬沙門氏菌外膜蛋白的表達(dá)及其免疫原性的研究.pdf

1、沙門氏菌（Salmonella）在全世界范圍內(nèi)廣泛分布，在所有的人和動物致病菌中占主要地位。其血清型種類大約有2600多種，具有廣泛的宿主，能夠感染人和多種動物引起沙門氏菌?。⊿almonellosis），人被沙門氏菌感染多與被污染的動物制品有關(guān)系。因此，該病在獸醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)上具有重要的意義。
　　亞單位疫苗具有安全性高、純度高、產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。近年來，外膜蛋白在新型診斷試劑和新型疫苗等方面出現(xiàn)的潛在性作用吸引了人們的特別關(guān)

2、注。BtuB、TolC、OmpX是革蘭氏陰性細(xì)菌的三個外膜蛋白，且在不同沙門氏菌中具有較高的保守性，能夠引起宿主強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，是亞單位疫苗的候選蛋白。
　　因此，本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬沙門氏菌外膜蛋白BtuB、TolC、OmpX，并研制新型的豬沙門氏菌亞單位疫苗，同時利用小鼠模型評價了其免疫原性和免疫保護(hù)性。主要完成的研究工作如下：
　　1.比較和分析btuB、tolC、ompX基因核苷酸序列

3、>　　通過NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫，下載多種致病性沙門氏菌的btuB、tolC、ompX基因核苷酸序列，并進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)btuB、tolC、ompX基因核苷酸序列在豬霍亂沙門氏菌C.500、豬霍亂沙門氏菌SC-B67、鼠傷寒沙門氏菌LT2、腸炎沙門氏菌EC20111175、雞白痢沙門氏菌S06004等菌株中的同源性均大于99％，可能在交叉免疫保

4、護(hù)方面具有良好的效果。
　　2.重組質(zhì)粒pET-28a-btuB、pET-28a-tolC、pET-32a-ompX的構(gòu)建
　　利用基因工程的方法，首先克隆btuB、tolC、ompX基因，進(jìn)行純化回收；用BamHⅠ、SacⅠ分別雙酶切btuB、tolC、ompX基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，連接到經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶處理過的pET-28a、pET-32a質(zhì)粒上，連接成功的pET-28a-btuB、pET-28a-tolC、

5、pET-32a-ompX經(jīng)過雙酶切鑒定和測序鑒定，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　3. BtuB、TolC及OmpX蛋白的表達(dá)、分離及純化
　　通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出BtuB、TolC及OmpX蛋白，并通過Western blot檢測進(jìn)一步驗證其正確性。BtuB、TolC及OmpX蛋白表達(dá)在包涵體中，經(jīng)過對表達(dá)條件的多次摸索后，蛋白仍然表達(dá)在包涵體中，故進(jìn)行了包涵體的分離與純化，同時對包涵體蛋白的分離純化方法進(jìn)行了摸索與

6、改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)“尿素法”得到的包涵體蛋白純度較高但濃度較低，然后“SKL法”得到的包涵體蛋白濃度較高但純度較低。經(jīng)過“尿素法”純化后得到的目的蛋白通過BCA法測定其濃度，BtuB、TolC及OmpX蛋白濃度分別為：0.79mg/mL、0.82mg/mL、0.49mg/mL。
　　4. BtuB、TolC、OmpX蛋白亞單位疫苗的制備及免疫效力的研究
　　將目的蛋白用1×TE Buffer稀釋到濃度約為500μg/mL，與等體積的

7、弗氏佐劑進(jìn)行充分乳化，制成BtuB、TolC、OmpX亞單位疫苗。每只小鼠免疫劑量為200μL，大約50μg蛋白，免疫2次。小鼠的免疫原性試驗的結(jié)果表明，這三種亞單位疫苗在小鼠體上均能誘導(dǎo)產(chǎn)生很好的抗沙門氏菌BtuB、TolC、OmpX蛋白的ELISA抗體，同時這三種蛋白都能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的脾淋巴細(xì)胞增殖。二免14d后用鼠傷寒沙門氏菌CVCC541進(jìn)行攻毒，攻毒劑量接近6×LD50（約為5.76×106CFU/mL）。攻毒后觀察14d，