副豬嗜血桿菌——豬霍亂沙門氏菌二聯(lián)基因工程疫苗研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）是常規(guī)飼養(yǎng)豬群上呼吸道中寄生的一種常在菌，但在動物體應(yīng)激、免疫力低下等情況下某些分離株可侵入機體并引發(fā)嚴重的全身性疾病，臨床特征主要表現(xiàn)為纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。近年來鑒于養(yǎng)殖場飼養(yǎng)模式的不斷調(diào)整以及新型呼吸道疾病的層出不窮，副豬嗜血桿菌病日趨流行，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害。
　　 近年來基因工程產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，使得疫苗的研發(fā)無論在方法上還是在觀念

2、上都發(fā)生了重大轉(zhuǎn)變。當(dāng)前應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建沙門氏菌減毒菌株和利用減毒沙門氏菌作為活載體表達外源抗原研制多聯(lián)疫苗等已成為研究熱點之一。本課題是基于豬霍亂沙門氏菌C500菌株△asd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)進行副豬嗜血桿菌-豬霍亂沙門氏菌二聯(lián)基因工程疫苗研發(fā)。基本思路是利用仔豬副傷寒商品疫苗菌株豬霍亂沙門氏菌C500作為宿主菌株，插入已經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選鑒定的副豬嗜血桿菌重要免疫原性基因hps06257、HbpB及PalA，從而獲得副豬嗜

3、血桿菌-豬霍亂沙門氏菌二聯(lián)基因工程疫苗菌株C501(06257)、C501(HbpB)、C501(PalA)，并對這些重組菌株進行生物學(xué)特性鑒定、安全性評價以及免疫效應(yīng)方面的研究，為臨床副豬嗜血桿菌病的防制提供新對策。
　　 首先擴增目的基因并將其連接至原核載體質(zhì)粒pYA3493中，獲得中間質(zhì)粒pYA-06257、pYA-HbpB、pYA-PalA。再將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至豬霍亂沙門氏菌asd基因缺失菌株C501中，構(gòu)建互補菌株C50

4、1(06257)、C501(HbpB)、C501(PalA)。PCR擴增鑒定和測序結(jié)果證實二聯(lián)基因工程疫苗菌株構(gòu)建成功。對上述重組菌株的生物學(xué)特性鑒定研究表明:1）重組菌株能夠正確表達目的蛋白且保持其原有免疫特性;2）外源質(zhì)?？稍谒拗骶曛蟹€(wěn)定遺傳，保證了疫苗菌株的遺傳穩(wěn)定性;3）外源基因的插入對于載體菌株的生長沒有特別影響;4）在碳代謝方面重組菌與親本菌生化特征一致，外源質(zhì)粒的克隆與表達不影響沙門氏菌自身的碳代謝。
　　 重組

5、菌株對小鼠的半數(shù)致死量檢測結(jié)果顯示，C501(06257)、C501(HbpB)、C501(PalA)與空質(zhì)粒對照菌株C501(pYA3493)在小鼠體內(nèi)LD50非常接近，證明外源基因片段的插入基本不影響載體菌的弱毒特性。在本體動物仔豬體內(nèi)進行重組疫苗菌株的安全性評估，結(jié)果表明口服或肌肉注射10倍免疫劑量（300億）的疫苗菌株后仔豬的采食、飲水及精神狀態(tài)均比較正常，機體只在接種后第二天發(fā)生輕微發(fā)熱之外并無其他明顯的臨床癥狀。
　　

6、 副豬嗜血桿菌-豬霍亂沙門氏菌二聯(lián)基因工程疫苗對小鼠的免疫效力評價試驗結(jié)果表明:針對副豬嗜血桿菌強毒株致死劑量攻毒，口服組的攻毒保護率明顯高于注射組，其中C501(HbpB)口服組、C501(PalA)口服組免疫小鼠分別具有83.3％、100％的保護率;針對豬霍亂沙門氏菌強毒株的致死攻毒結(jié)果表明，口服組的攻毒保護率略低于注射組，其中C501(HbpB)注射組、C501(PalA)注射組均能為機體提供87.5％的保護力。從整體來看不論是