重組PRRSVORF5基因減毒豬霍亂沙門氏菌C78-1生物學及免疫學特性初步研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)引起的以妊娠母豬流產、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬嚴重的呼吸道癥狀及高死亡率為特征的傳染病，并已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一。沙門氏菌作為一種細胞內侵襲性寄生菌，能有效的呈遞外源抗原，能同時激發(fā)機體產生抗沙門氏菌和誘導外源蛋白的細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫應答。本研究以攜帶 PRRSV ORF5基因的重組減毒豬霍亂沙門氏菌為研究對象，檢測了其生物學特性和免疫學特性，為P

2、RRS新型基因工程疫苗的研究和減毒豬霍亂沙門氏菌攜帶和表達外源基因的可行性提供了新的思路。
　?。?）實現(xiàn)了PRRSV ORF5的原核表達將PRRSV ORF5基因的N端的31個氨基酸的信號肽編碼序列截去，構建了原核表達載體pET28a-dORF5并實現(xiàn)了高效表達，經SDS-PAGE和Western-blot檢測表明，表達的PRRSV GP5重組蛋白具有良好的反應原性。進而將表達的 GP5蛋白經鎳柱純化并復性后，得到了純化和復性的

3、 GP5蛋白，為進一步研究 GP5蛋白的生物學功能奠定了良好的基礎。
　?。?）重組PRRSV ORF5減毒豬霍亂沙門氏菌的生物學特性研究對重組菌的表型性狀、生長特性、穩(wěn)定性以及安全性等生物學特性進行檢測，并對其表達的GP5蛋白進行SDS-PAGE和Western blot分析。結果顯示，該重組菌株恢復了在 DAP陰性環(huán)境中生存的能力；同時不能利用麥芽糖、果糖及蔗糖等碳源，但仍能夠利用葡萄糖，其生長速度明顯低于強毒株 C78-1，

4、而與?crp?asdC78-1相比沒有明顯變化；在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)能夠穩(wěn)定遺傳578 bp dORF5基因片段。Western-blot分析證實重組菌表達的 GP5蛋白能與 PRRSV陽性血清特異性結合；通過口服感染的途徑，測得親本株 C78-1的毒力是重組菌?crp?asdC78-1(pYA-dORF5)的492倍，而疫苗株C500的毒力是重組菌的1.31倍。
　?。?）重組PRRSV ORF5減毒豬霍亂沙門氏菌免疫學特性初步研

5、究將重組菌接種小鼠，對其在小鼠體內的分布情況進行了檢測。同時，分別應用 ELISA方法檢測小鼠不同時期血清中抗PRRS GP5抗體、沙門氏菌抗體和腸液中SIgA抗體的產生情況以及 MTT法檢測淋巴細胞分化情況，以了解重組菌的免疫學特性。結果顯示，重組菌能夠在小鼠體內穩(wěn)定存活，具有良好的侵襲力。血清抗體IgG檢測結果顯示，在二次免疫后第1周，抗 GP5抗體達到高峰，OD值達到0.788，此時空白菌對照組和 PBS對照組的 OD值僅為0.0