豫西地區(qū)PRRSV分子流行病學(xué)調(diào)查及重組ORF5減毒沙門(mén)氏菌的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的豬的急性高度接觸性傳染病，常引起母豬的繁殖障礙及仔豬發(fā)生呼吸道癥狀為特征的疾病。近年來(lái)，PRRSV變異毒株不斷出現(xiàn)，給該病的預(yù)防和控制帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。采用減毒沙門(mén)氏

2、菌通過(guò)黏膜感染途徑運(yùn)送 DNA疫苗已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本研究以減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌?crpC78-1株為基礎(chǔ)構(gòu)建了 asd基因突變的平衡致死系統(tǒng)，以此系統(tǒng)攜帶了 PRRSV主要抗原基因ORF5基因，探討 PRRS新型疫苗及該平衡致死系統(tǒng)攜帶、表達(dá)外源基因的可行性。主要內(nèi)容包括：
　　1．豫西地區(qū)PRRS分子流行病學(xué)調(diào)查
　　本研究通過(guò)對(duì)豫西地區(qū)21份陽(yáng)性病料的ORF5基因擴(kuò)增、測(cè)序表明：21個(gè)ORF5基因核酸序列間同源性為

3、96.5％～100%，與 JXA1、MLV、VR-2332和LV的同源性分別為96.6%～98.9%，88.4%～89.2%，88.0%～89.5%和66.8%～67.3%。對(duì)21份陽(yáng)性病料的部分 Nsp2基因擴(kuò)增、測(cè)序表明：所得到的21個(gè)PRRSV流行株的部分Nsp2基因與已報(bào)道的美洲株VR-2332的Nsp2基因相比雖不存在核苷酸的插入或突變，但均存在兩個(gè)位點(diǎn)共計(jì)90個(gè)堿基的缺失。本研究澄清了豫西地區(qū) PRRSV新近流行毒株 ORF

4、5基因的變異情況及 Nsp2基因的結(jié)構(gòu)特征，為本地區(qū)PRRS的防控措施的制定與實(shí)施提供了理論指導(dǎo)。
　　2．豬霍亂沙門(mén)氏菌C78-1株?crp?asd缺失株平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定
　　以含有自殺性質(zhì)粒 pREΔasd的大腸桿菌χ7213為供體菌、減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌?crpC78-1為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，兩步法篩選 asd基因的突變株，經(jīng)PCR及測(cè)序表明?crp?asdC78-1減毒株構(gòu)建成功，該菌株失去了在 DAP陰性環(huán)境

5、中生存的能力；不能利用麥芽糖、蔗糖及果糖等碳源，但保留了利用葡萄糖的能力；其血清型與強(qiáng)毒株C78-1一致，能夠穩(wěn)定遺傳315bp的缺失片段。然后將asd+的原核表達(dá)質(zhì)粒PYA3493轉(zhuǎn)入?crp?asdC78-1，經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定表明豬霍亂沙門(mén)氏菌平衡致死系統(tǒng)?crp?asdC78-1(PYA3493)構(gòu)建成功，與強(qiáng)毒株 C78-1及豬霍亂沙門(mén)氏菌弱毒疫苗株 C500相比，?crp?asdC78-1(PYA3493)毒力分別下降780

6、倍和1.5倍，該系統(tǒng)可作為疫苗活載體來(lái)穩(wěn)定攜帶外源基因。
　　3．重組PRRSV的ORF5減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌的構(gòu)建及鑒定
　　采用RT-PCR的方法擴(kuò)增得到去除PRRSV ORF5 N端信號(hào)肽的dORF5基因，并將其克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒 PYA3493上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒 PYA-dORF5，進(jìn)而將PCR及酶切鑒定正確的PYA-dORF5電轉(zhuǎn)化入所構(gòu)建的豬霍亂沙門(mén)氏菌 C78-1株?crp?asd缺失菌。將經(jīng) PCR及測(cè)序鑒定