表達豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白重組沙門氏菌的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒（Porcine eircovirus type2，PCV2）是當前嚴重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。該病毒與豬的多種疾病綜合征有關，特別是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，隨后以極高的感染率迅速在全球蔓延流行，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、蒼白及黃疸等。PCV2在豬群中的感染率非常高，但多為隱性感染，該病主要侵害機體的免疫系統(tǒng)，導致免疫抑制，造成繼發(fā)感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成

2、巨大的經(jīng)濟損失。對本病的預防除加強飼養(yǎng)管理、搞好環(huán)境衛(wèi)生和減少應激外，最主要的途徑就是依靠疫苗，因此，研制安全、高效、制備方便和廉價的新型基因工程疫苗成為越來越多研究者關注的焦點。
　　 本研究對PCV2新型疫苗進行了新的探索，構(gòu)建了利用豬霍亂沙門氏菌載體系統(tǒng)表達Cap蛋白的重組菌，利用重組菌對小鼠進行了免疫學效力研究，主要研究內(nèi)容如下：
　　 1．豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白單克隆抗體的制備
　　 利用本實驗室構(gòu)建

3、的PCV2-ORF2重組菌經(jīng)IPTG誘導表達，得到融合蛋白GST-Cap，采用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠對可溶性蛋白進行純化，并作為免疫原采取常規(guī)皮下免疫與尾靜脈沖擊免疫結(jié)合的方式免疫BALB/c小鼠。取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）篩選，采用有限稀釋法進行克隆，經(jīng)過3次克隆后獲得了2株抗Cap蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為3E5和4H8。Western-blot和間接免疫熒光結(jié)果顯示3E5和

4、4H8株單克隆抗體能與Cap蛋白和PCV2發(fā)生特異性反應。其抗體亞類類型分別為IgG2a和IgG2b，輕鏈為κ型，細胞培養(yǎng)上清效價均為1：1024，小鼠腹水效價分別為1：409600和1：204800。這2株單抗的獲得為進一步研究PCV2-ORF2基因的功能及建立準確快速診斷PCV2的方法提供了強有力的手段。
　　 2．表達豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白重組沙門氏菌的構(gòu)建及鑒定
　　 根據(jù)GenBank中的已知序列設計2對引物

5、，分別擴增PCV2-ORF2全基因和去核定位序列的ORF2基因，然后將兩個片段分別亞克隆至含asd+基因及β-lactamase信號序列的原核表達質(zhì)粒pYA3493中，得到重組質(zhì)粒pYA-ORF2和pYA-△41ORF2。將pYA-ORF2、pYA-△41ORF2和pYA3493分別電轉(zhuǎn)化豬霍亂沙門氏菌C500的asd缺失株C501中，制備重組菌株C501（pYA-ORF2）、C501（pYA-△41ORF2）和空載體菌株C501（pY

6、A3493）。SDS-PAGE鑒定表明，去核定位信號的ORF2基因可以表達，而含全基因序列的ORF2基因未表達。Western-blot結(jié)果表明：去核定位信號的ORF2基因表達的蛋白可以與抗PCV2-ORF2單克隆抗體發(fā)生特異性反應。研究結(jié)果表明，重組菌株C501（pYA-△41ORF2）不僅保留了親本菌株C500的表型特征，且能穩(wěn)定遺傳并分泌表達外源蛋白。將5.9×10 CFU的重組菌C501（pYA-△41ORF2）分別以口服和肌肉