豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白B細(xì)胞表位的預(yù)測及鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus, PCV）是單鏈環(huán)狀無囊膜DNA病毒，為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，是目前已知的最小的動(dòng)物病毒之一。根據(jù)其抗原性、基因組成和致病性的不同，可分成 PCV1和 PCV2兩類，其中 PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，同時(shí)能引發(fā)多種病原的混合性感染和繼發(fā)性感染，增加了疾病防控的難度，使養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生了很大的影響。Cap（Capsid protein, Cap）蛋白是PCV2唯一的結(jié)構(gòu)

2、蛋白，含有主要的中和表位，并參與宿主的保護(hù)性免疫反應(yīng)，是疾病診斷和疫苗制備的首選對象。本研究旨在篩選 PCV2 Cap蛋白的B細(xì)胞線性表位，以期為 PCV2的檢測及疫苗的研制提供理論指導(dǎo)。
　　本研究首先從NCBI中獲取PCV2 KF氨基酸序列，通過構(gòu)建同源樹確定其為PCV2b基因型。運(yùn)用DNAStar預(yù)測PCV2 Cap蛋白的結(jié)構(gòu)特性。再利用 ABCpred和 Bepipred1.0預(yù)測 Cap蛋白的 B細(xì)胞表位。綜合分析多個(gè)參

3、數(shù)，初步確定 Cap蛋白潛在的 B細(xì)胞線性表位主要位于58-66、79-91、151-162、174-189、204-213和221-233位氨基酸。
　　根據(jù)預(yù)測結(jié)果，將Cap蛋白基因多次分段，利用 Primer5設(shè)計(jì)特異性引物，分別引入 BamHⅠ和 HindⅢ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增 Cap蛋白分段基因，并克隆至 pET32a（+）原核表達(dá)載體上，從而獲得重組載體并測序。將序列無誤的重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌 BL21（DE3）plys

4、S中，在 IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白，SDS-PAGE分析和 Western-blot鑒定顯示，分段蛋白均成功表達(dá)。利用PCV2陽性血清篩選優(yōu)勢 B細(xì)胞線性表位區(qū)段，結(jié)果顯示 Cap77-95、Cap174-189和 Cap221-233能與血清進(jìn)行特異性結(jié)合。在 NCBI數(shù)據(jù)庫中對獲得的表位肽段進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)3個(gè)片段均為 PCV2 Cap蛋白的特有序列。通過同源建模獲取Cap蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并預(yù)測表位的空間分布情況，結(jié)果顯示篩選的