豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建與篩選.pdf

1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus, PCV2）是引起豬圓環(huán)病毒病（Porcine circovirus disease, PCVD）的主要病原，它能損害患病仔豬的免疫系統(tǒng)，引發(fā)其他多種病原混合感染或繼發(fā)性感染，導(dǎo)致豬的繁殖能力嚴(yán)重下降，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2感染的早期診斷對 PCVD的綜合防控具有重大意義。目前，針對 PCV2病原的快速檢測方法主要有膠體金免疫層析試紙法和ELISA檢測方法等，其所用抗

2、體主要是基于雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體，傳統(tǒng)單克隆抗體存在生產(chǎn)周期長、成本高、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了 PCV2快速、高效、廉價(jià)的檢測方法的研制。而基因工程方法制備的單鏈抗體具有生產(chǎn)周期短，成本低、易于改造等優(yōu)點(diǎn)，其有望取代傳統(tǒng)單抗用于 PCV2新型免疫學(xué)檢測方法的研制。實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　1. PCV2 Cap蛋白的純化及鑒定
　　本實(shí)驗(yàn)將重組表達(dá)載體 pET28a-ORF2轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21中，

3、用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用 Ni-NTA親和層析法對目的蛋白進(jìn)行純化，并對蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白分子量約26 kDa，主要以可溶形式存在，且能被 His單克隆抗體特異性識別，純化后的重組蛋白純度比較高。用此蛋白免疫 BALB/C鼠，免疫后，經(jīng) ELISA檢測，測得鼠血清中抗體滴度達(dá)1∶64000，同時(shí)用 PCV2抗體檢測試紙對鼠血清進(jìn)行檢測，結(jié)果為陽性。本實(shí)驗(yàn)制備的重組 Cap蛋白具有可溶性好、純度高、免疫原性好等特點(diǎn)，為

4、 Cap蛋白單鏈抗體庫的構(gòu)建提供了必要的實(shí)驗(yàn)材料。
　　2. PCV2 Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及淘選
　　選取免疫效果較好的小鼠脾臟，提取其脾臟總 RNA，再以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)基因（Heavy chain variable region of antibody, VH）和抗體的輕鏈可變區(qū)基因（Light chain variable region of antibody, VL）

5、，經(jīng)重疊PCR將VH與VL用多肽(G4S)3連接，獲得單鏈抗體基因（Single chain antibody variable region gene fragment, ScFv）。經(jīng)輔助噬菌體輔助侵染后獲得噬菌體單鏈抗體庫，用 Cap蛋白作為包被原篩選 PCV2單鏈抗體克隆，獲得3株與 Cap蛋白特異性反應(yīng)的噬菌體克隆。取特異性及反應(yīng)性相對較高的克隆測序，獲得 PCV2單鏈抗體基因，并用 ELISA鑒定 ScFv-P18菌株的誘導(dǎo)