減毒豬霍亂沙門(mén)菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1平衡致死系統(tǒng)及其PRRSVORF5-ORF6重組菌株的構(gòu)建.pdf

1、豬霍亂沙門(mén)菌是造成仔豬副傷寒和人類(lèi)食物中毒的重要人畜共患病病原。通過(guò)基因工程缺失致弱得到的沙門(mén)菌突變株不僅可以作為高效的弱毒疫苗，還可以進(jìn)一步引入asd無(wú)抗性平衡致死系統(tǒng)將其開(kāi)發(fā)為能攜帶多種外源保護(hù)性抗原的活疫苗載體。因此，篩選合適的減毒菌株構(gòu)建高效活疫苗載體一直是疫苗學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　本試驗(yàn)首先運(yùn)用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的兩步法同源重組技術(shù)，在豬霍亂沙門(mén)菌單缺失株?crpC78-1的基礎(chǔ)上先缺失 cya基因，構(gòu)建了毒力更弱且保留良

2、好免疫原性的雙缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1，然后再缺失 asd基因?qū)⑵溟_(kāi)發(fā)為平衡致死系統(tǒng)。最后以此為載體攜帶PRRSV ORF5和ORF6融合基因，為開(kāi)發(fā)預(yù)防仔豬副傷寒和PRRS的二聯(lián)疫苗奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　1.豬霍亂沙門(mén)菌雙缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1的篩選與鑒定
　　以豬霍亂沙門(mén)菌單缺失株?crpC78-1為模板，擴(kuò)增 cya基因的上、下臂片段cya1和 cya2，然后將二者克隆至中

3、間轉(zhuǎn)移載體 pBluescriptSK(+)，再將串聯(lián)的cya1+cya2片段插入自殺性質(zhì)粒 pRE112，最后將重組自殺性質(zhì)粒 pREΔcya導(dǎo)入宿主大腸桿菌χ7213。以χ7213（pRE?cya）為供體菌，ΔcrpC78-1為受體菌，運(yùn)用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的兩步法同源重組技術(shù)篩選豬霍亂沙門(mén)菌雙缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1。
　　2.豬霍亂沙門(mén)菌雙缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1的生物學(xué)特性檢測(cè)
　　對(duì)雙

4、缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1的生化和生長(zhǎng)特性、缺失基因的穩(wěn)定性、對(duì)小鼠的毒力以及免疫保護(hù)等生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)，并將其與?crpC78-1、ΔcyaC78-1以及疫苗株 C500進(jìn)行比較。研究結(jié)果顯示，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1利用碳源的能力與ΔcyaC78-1和ΔcrpC78-1完全相同，保留了利用葡萄糖的能力，降低了利用半乳糖的能力，完全喪失了利用麥芽糖、鼠李糖、木糖等碳源的能力；其平均世代間隔為48.2min；其

5、口服LD50是ΔcrpC78-1的204倍，是疫苗株C500的322倍；用其口服免疫小鼠109CFU，能對(duì)野毒株10LD50CFU的攻擊提供100％的保護(hù)。
　　3.減毒豬霍亂沙門(mén)菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1平衡致死系統(tǒng)的的構(gòu)建與鑒定
　　以攜帶重組自殺性質(zhì)粒 pREΔasd的大腸桿菌χ7213為供體菌，減毒豬霍亂沙門(mén)菌雙缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1為受體菌，利用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的兩步法同源重組技術(shù)篩選Δc

6、rpΔcyaΔasdC78-1三缺失株。 PCR及測(cè)序結(jié)果表明ΔcrpΔcyaΔasdC78-1三缺失株構(gòu)建成功。進(jìn)而本試驗(yàn)將含 asd+基因的質(zhì)粒pYA3493成功地電轉(zhuǎn)入該三缺失株，構(gòu)建了平衡致死系統(tǒng)ΔcrpΔcyaΔasdC78-1（pYA3493），該菌株能夠在不含DAP的普通培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。
　　4.重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1（pYA-ORF5-ORF6）的構(gòu)建與鑒定
　　采用RT-P

7、CR擴(kuò)增PRRSV的ORF5和ORF6基因，并將其先后插入原核表達(dá)載體 pYA3493，經(jīng) PCR、酶切及測(cè)序鑒定正確之后，將重組載體 pYA-ORF5-ORF6電轉(zhuǎn)入減毒豬霍亂沙門(mén)菌三缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1。PCR及雙酶切鑒定結(jié)果表明重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA-ORF5-ORF6)構(gòu)建成功。將該重組菌在 LB固體培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接60代，每十代進(jìn)行一次 PCR鑒定，均能擴(kuò)增出預(yù)期的目