桿狀病毒泛素、多角體基因啟動(dòng)子分析及表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用.pdf

1、本文圍繞桿狀病毒泛素(ubiquitin,ubi)基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及功能元件、桿狀病毒IE1及hr3對晚期ubi和極晚期polh啟動(dòng)子的作用、參與桿狀病毒晚期基因泛素表達(dá)的病毒因子、耐高溫β-glucosidase在家蠶中的表達(dá)及純化等方面作了一定的研究。 (1)桿狀病毒ubiquitin基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及功能元件的分析克隆的啟動(dòng)子與BmNPVT3株及AcMNPVC6株ubi啟動(dòng)子的同源性分別為98.9％、99.5％，二者之間的同源

2、性為92.8％。該序列中具有兩個(gè)桿狀病毒晚期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TAAG和兩個(gè)TATAbox，三個(gè)CAAT。Northernblot證明桿狀病毒ubi為晚期表達(dá)基因，在病毒感染后約12h或更早開始大量表達(dá)，并具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。 ubi啟動(dòng)子區(qū)域缺失分析證明Acubi啟動(dòng)子對病毒因子的主要響應(yīng)區(qū)在ATG上游-595～-382bp；而Bmubi啟動(dòng)子中則主要位于ATG上游-382～-124bp；在ATG上游-383～-187bp的196b

3、p啟動(dòng)子片段，含有一個(gè)TAAG、CAAT基序和TATAbox，也具有啟動(dòng)子的活性。 對ubi啟動(dòng)子進(jìn)行突變分析發(fā)現(xiàn)，TATAbox和TAAG突變后均能下調(diào)該啟動(dòng)子的活性，而CAAT突變卻可以上調(diào)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性大約3至4倍左右。 (2)桿狀病毒IE-1及hr3對晚期ubi和極晚期polh啟動(dòng)子的作用在病毒感染的情況下，順式連接或反式作用的hr3可分別上調(diào)ubi啟動(dòng)子活性達(dá)62和1.4倍左右；與ie-1共轉(zhuǎn)染時(shí)，順式連接的

4、hr3可上調(diào)ubi啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄約210；反式作用則為9倍。ubi啟動(dòng)子序列中與ie-1響應(yīng)的區(qū)段主要位于ATG上游-595～-382bp之間。 對于極晚期polh啟動(dòng)子，在BmNPV感染的細(xì)胞中，順式連接的hr3可增強(qiáng)報(bào)告基因表達(dá)283倍，反式作用為1.8倍左右；報(bào)告質(zhì)粒與ie-1共轉(zhuǎn)染時(shí)，順式或反式的hr3可分別增強(qiáng)polh啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因表達(dá)621倍和4.2倍。 用報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶5齡第二天的幼蟲，hr3同樣可顯著

5、提高ubi和polh啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。 (3)參與桿狀病毒晚期基因ubi表達(dá)的病毒因子研究通過構(gòu)建BmNPV基因組文庫，對參與ubi基因轉(zhuǎn)錄的病毒因子進(jìn)行了篩選。單獨(dú)的立即早期基因ie0、ie2、pe38等對ubi基因啟動(dòng)子沒有激活作用，ie-1能反式激活ubi基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但報(bào)告基因的表達(dá)量較低。在ie-1存在時(shí)，he65、lef-11、lef-6、p35及gp118-gp119，gp104-gp107片段均能啟動(dòng)ubi啟

6、動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 (4)耐高溫β-glucosidase在家蠶中的表達(dá)及純化獲得了能夠表達(dá)β-glucosidase的重組病毒。酶活性為10199.5U/毫升血淋巴，19797.4U/頭蠶。酶的最適反應(yīng)溫度為105℃，最適反應(yīng)pH為5.0，在90-110℃保溫10min，酶活性沒有大的影響，當(dāng)溫度升高到140℃時(shí)，酶活才會急劇下降；二價(jià)離子及高鹽對表達(dá)的β-glucosidase活性均沒有顯著影響。初步純化的上清酶液中含有約80％以