家蠶核型多角體桿狀病毒BmNPV orf98基因的功能分析.pdf

1、桿狀病毒(Baculovirus)是昆蟲病毒類中的最大的類群之一，它編碼的蛋白質(zhì)種類有90到180種，基因組大小為80～180 kb之間。目前家蠶桿狀病毒(BmNPV)大部分基因的功能都已被研究，但仍然有一些基因的功能至今未知。因此，本論文就家蠶核型多角體桿狀病毒BmNPV orf98基因?yàn)檠芯繉?duì)象，研究該基因?qū)Σ《净蚪M的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及病毒包裝和基因表達(dá)等方面的影響。家蠶核型多角體病毒BmNPV orf98基因不是桿狀病毒的核心基因，

2、此基因的插入或刪除對(duì)BmNPV傳染性沒有明顯的影響，但在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和包裝等方面的影響至今未見報(bào)道。為了研究BmNPV orf98基因功能，通過λRed重組系統(tǒng)進(jìn)行定點(diǎn)敲除BmNPV orf98基因，構(gòu)建缺失型重組病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系統(tǒng)異位補(bǔ)回BmNPV orf98基因，構(gòu)建補(bǔ)回型重組病毒Bm98-re-Bacmid。將野生型病毒(WtBacmid)、缺失型病毒（Bm98-ko-Bacmid）和

3、補(bǔ)回型（Bm98-re-Bacmid）分別轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN。病毒滴度檢測結(jié)果顯示Bm98-ko-Bacmid可形成侵染性的病毒粒子，但數(shù)量降低;透射電子顯微鏡結(jié)果表明Bm98-ko-Bacmid只產(chǎn)生游離的桿狀病毒粒子，數(shù)量明顯減少，而WtBacmid和Bm98-re-Bacmid產(chǎn)生大量成熟的具有囊膜結(jié)構(gòu)的病毒粒子。熒光定量PCR結(jié)果顯示BmNPV orf98基因缺失對(duì)BmNPV病毒復(fù)制沒有影響，但早期基因lef3、晚期基因vp39

4、和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄水平而顯著降低(p＜0.05)。上述結(jié)果表明:BmNPVorf98基因?qū)Σ《镜膹?fù)制是非必需的，但該基因的缺失引起早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10轉(zhuǎn)錄水平明顯下降(p＜0.05)。為了研究BmNPV orf98的基因表達(dá)，構(gòu)建了BmNPV orf98的原核表達(dá)載體，表達(dá)融合蛋白并制備多克隆抗體進(jìn)行Western印跡。結(jié)果表明:用該融合蛋白作為抗原進(jìn)行Western印跡，條帶單一且濃，說明抗體可用

5、。然后用該抗體和轉(zhuǎn)染了補(bǔ)回型病毒的家蠶細(xì)胞進(jìn)行Western結(jié)果顯示:隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，ORF98蛋白在家蠶(BmN)細(xì)胞中的表達(dá)量也隨之增長。綜合研究結(jié)果表明:BmNPV orf98基因?yàn)椴《緩?fù)制非必需基因，但該基因的缺失能夠抑制病毒增殖和包裝，且導(dǎo)致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄顯著下降(p＜0.05)。BmNPVorf98基因編碼的蛋白在不同表達(dá)時(shí)相分析，隨著時(shí)間的延長，該蛋白表達(dá)量也隨

6、之增多。
　　在桿狀病毒基因組上將目的基因敲除或者突變是研究未知功能病毒基因最有效的方法。在本文中，通過Red重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)分別構(gòu)建Bm98-ko-Bacmid和Bm98-re-Bacmid兩種重組病毒，然后將wtBacmid、Bm98-ko-Bacmid和Bm98-re-Bacmid病毒DNA分別轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞(BmN)，收集不同時(shí)相的病毒上清并進(jìn)行10-1～10-12的梯度稀釋，五天后統(tǒng)計(jì)細(xì)胞發(fā)病孔數(shù)和未發(fā)病

7、孔數(shù)，按照相應(yīng)的公式計(jì)算TCID50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長3種病毒的TCID50也隨之增大，將收集的病毒上清進(jìn)行二次感染，細(xì)胞仍然發(fā)病，說明缺失型病毒仍然能產(chǎn)生具有感染性的BV。但在同一時(shí)相，缺失型病毒的TCID50低于wtBacmid和Bm98-re-Bacmid病毒且缺失型病毒轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞發(fā)病時(shí)間較其它兩者晚，說明該基因的缺失推遲了病毒發(fā)病時(shí)間，抑制了病毒的增殖;而將該基因補(bǔ)回后病毒滴度恢復(fù)到野生型水平，說明這種缺陷能通

8、過基因補(bǔ)回得到恢復(fù)且BmNPV orf98不是BmNPV病毒粒子裝配的必需基因。而后在透射顯微鏡下觀察48 h時(shí)相三種病毒粒子的包裝情況，結(jié)果顯示缺失型病毒只產(chǎn)生游離的桿狀病毒粒子，且數(shù)量明顯減少，而野生型和補(bǔ)回型病毒產(chǎn)生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子;為了進(jìn)一步了解BmNPV orf98的作用機(jī)制，將三種病毒分別轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，熒光定量分析結(jié)果顯示野生型、缺失型和補(bǔ)回型3種病毒的復(fù)制水平保持一致，無顯著性差異(p＞0.05)，但該基因的

9、缺失導(dǎo)致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄顯著下降(p＜0.05);在轉(zhuǎn)染48 h和72 h時(shí)相，wtBacmid和Bm98-re-Bacmid病毒的轉(zhuǎn)錄水平趨于一致且明顯高于Bm98-ko-Bacmid的轉(zhuǎn)錄水平。為了研究BmNPV orf98的基因編碼的蛋白在不同時(shí)相的表達(dá)，構(gòu)建了BmNPV orf98的原核表達(dá)載體，表達(dá)融合蛋白并制備多克隆抗體進(jìn)行Western印跡。結(jié)果表明:用該融合蛋白作為

10、抗原進(jìn)行Western印跡，條帶單一且濃，說明抗體可用。然后用該抗體和轉(zhuǎn)染了補(bǔ)回型病毒的家蠶細(xì)胞進(jìn)行Western印跡結(jié)果顯示:隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，BmNPV orf98蛋白在家蠶(BmN)細(xì)胞中的表達(dá)量也隨之增長。綜合研究結(jié)果表明:BmNPV orf98基因?yàn)椴《緩?fù)制非必需基因，但該基因的缺失抑制了病毒的增殖和包裝，且導(dǎo)致BmNPV病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄顯著下降(p＜0.05)。同時(shí)，BmNPV