靈菌紅素抑制家蠶核型多角體病毒BmNPV核酸復(fù)制和基因表達(dá)的q-PCR分析.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）屬于桿狀病毒科的一種環(huán)狀雙鏈超螺旋 DNA(dsDNA)病毒。根據(jù)感染進(jìn)程的不同，BmNPV呈現(xiàn)出兩種不同的病毒粒子表型，即芽殖病毒(budded virus，BV)和包涵體病毒(ODV)。BV依賴囊膜融合蛋白GP64引起細(xì)胞間的感染，而ODV形成于感染晚期，包埋于穩(wěn)定的蛋白結(jié)晶體中，主要造成家蠶個(gè)體間的感染。BmNPV病毒基因的表達(dá)以DNA的復(fù)制為界限可分為兩個(gè)時(shí)期，即早期和晚期，分別又可細(xì)分為極早期、

2、早期、晚期和極晚期。研究顯示，極早期基因ie-1、晚期基因vp39和極晚期基因p10可以被用作marker基因來(lái)評(píng)估BmNPV的增殖過(guò)程。靈菌紅素是具有三個(gè)吡咯環(huán)的微生物次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)靈菌紅素具抑制 BmNPV增殖的作用。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，進(jìn)一步論證靈菌紅素的抗 BmNPV病毒活性。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴收集病毒感染72h后的培養(yǎng)基上清，采用空斑法測(cè)定BmNPV子代病毒滴度。結(jié)果顯

3、示，靈菌紅素能顯著地抑制子代病毒BV的產(chǎn)生。對(duì)照組子代病毒BV的產(chǎn)生量顯著高于靈菌紅素處理組，分別為100 nM靈菌紅素處理組和10 nM靈菌紅素處理組BV產(chǎn)生量的105和103倍。通過(guò)顯微計(jì)數(shù)的方法計(jì)算形成包涵體OB的細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，靈菌紅素能夠影響病毒包涵體在細(xì)胞中的形成。隨著靈菌紅素濃度的增加，形成包涵體的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，當(dāng)靈菌紅素濃度為100nM時(shí)，細(xì)胞中形成包涵體的細(xì)胞數(shù)僅為4.45％。⑵利用q-PCR檢測(cè)靈菌紅素對(duì)病毒

4、基因組DNA復(fù)制的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著B(niǎo)mNPV感染時(shí)間的增加，對(duì)照組病毒DNA增加顯著，而靈菌紅素處理組病毒DNA增加較緩慢，總量遠(yuǎn)低于對(duì)照組。其中，BmNPV感染48h、72h和96h后，靈菌紅素處理組病毒 DNA總量?jī)H分別為對(duì)照組病毒DNA總量的3.0%、1.3%和5.7%。研究結(jié)果表明，靈菌紅素可顯著地抑制BmNPV病毒基因組DNA的復(fù)制。⑶采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)靈菌紅素對(duì)BmNPV基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，靈菌紅素

5、對(duì)BmNPV極早期基因ie-1、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄均有強(qiáng)烈的抑制作用。BmNPV感染72 h后，對(duì)照組病毒 ie-1表達(dá)量約為靈菌紅素處理組的55倍；靈菌紅素處理組vp39的表達(dá)量只有對(duì)照組的1.1%；而靈菌紅素處理組p10基因的表達(dá)量極低，幾乎檢測(cè)不出。⑷弱酸性條件下，BmNPV表達(dá)的GP64蛋白可介導(dǎo)感染細(xì)胞發(fā)生膜融合。試驗(yàn)分別用低pH（pH4.5）和細(xì)胞正常生長(zhǎng)所需pH（pH6.2）培養(yǎng)基短暫孵育BmNPV感