家蠶核型多角體病毒ORF71和ORF54的功能研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）是專門感染家蠶（Bombyx mori）的雙鏈環(huán)狀DNA病毒.BmNPV（T3株）病毒全長128，413個核苷酸，編碼136個開放閱讀框(ORFs).本研究以BmNPV兩個非核心基因ORF71和ORF54為研究對象，構(gòu)建了基因缺失型病毒，并研究了基因缺失病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況、對病毒形態(tài)的影響和對宿主幼蟲的感染力。主要結(jié)果如下:
　　 1.Bm71位于基因組66714-67517nt，全長804b

2、p，編碼267個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量為30 kDa。在Bm71起始密碼子上游434、401、288nt處發(fā)現(xiàn)早期轉(zhuǎn)錄基序CAGT，在起始密碼子上游298、193、154nt處發(fā)現(xiàn)早期轉(zhuǎn)錄基序GATA，在295 nt處發(fā)現(xiàn)晚期轉(zhuǎn)錄基序TAAG.在終止密碼子下游490nt處發(fā)現(xiàn)poly(A)加尾信號AATAAA.Bm71氨基酸序列沒有預(yù)測到信號肽序列和跨膜區(qū)，但是在第116、190氨基酸處檢測到N糖基化位點（N-glycosylat

3、ion sites）和第177氨基酸處的PKC磷酸化位點(Kinase specificphosphorylation sites).并且，Bm71氨基酸序列含有鋅指結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈，此外還有一個堿性區(qū)域和一個酸性區(qū)域.預(yù)測該蛋白在宿主或病毒感染過的細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位為宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。
　　 2.Bm71基因起始密碼子下游426bp的位置有一個PstⅠ酶切位點，用λRed同源重組方法將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）插入該酶切

4、位點，使Bm71基因不能正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并利用Tn-7轉(zhuǎn)座重組將綠色熒光蛋白基因egfp和多角體蛋白基因ph重組到BmNPVbacmid的ph位點，從而成功構(gòu)建了Bm71基因敲除病毒.
　　 3.Bm71敲除病毒可以感染家蠶細(xì)胞，但是產(chǎn)生的BV滴度大大降低.與野生型病毒相比，Bm71敲除病毒殺死家蠶五齡幼蟲的時間延長了約7.5個小時.而Bm71基因的異位補(bǔ)回能夠拯救這種缺陷。Bm71敲除病毒感染的細(xì)胞內(nèi)能夠產(chǎn)生正常形態(tài)的核衣殼和

5、多角體.
　　 4.Bm54 ORF全長2，418bp，位于基因組50462-52879nt，編碼分子量為93 kDa、等電點pI為5.30的蛋白。在Bm54 ORF起始密碼子上游25和217nt處發(fā)現(xiàn)兩個桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序(TAAG)，暗示Bm54可能是個晚期轉(zhuǎn)錄基因.另外，在終止密碼子下游299nt處發(fā)現(xiàn)一個典型的poly(A)加尾信號（AATAAA）.對Bm54氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)沒有信號肽、核定位信號以及跨膜結(jié)構(gòu)域

6、存在。但是Bm54氨基酸序列含有一個desmoplakinN-terminus domain.
　　 5.Bm54的轉(zhuǎn)錄時相和表達(dá)時相分析結(jié)果表明，該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從3 hp.i.到72 h p.i.均可以檢測到，表明Bm54是一個從早期到晚期轉(zhuǎn)錄的基因.Bm54蛋白的表達(dá)從6 h p.i.可以檢測到并持續(xù)高表達(dá)到感染后期。
　　 6.Bm54蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，在感染后72 h，熒光集中在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核

7、也有微弱熒光，說明Bm54基因產(chǎn)物主要定位在細(xì)胞質(zhì)，與前面序列分析結(jié)果一致。Bm54蛋白在病毒結(jié)構(gòu)中的定位分析表明，該蛋白是ODV結(jié)構(gòu)組分，定位于ODV的囊膜。
　　 7.用948 bp的cat基因替換Bm54 ORF上一段519 bp的區(qū)域，從BmNPV基因組敲除Bm54基因，Bm54上游的835 bp和下游的1，065 bp則保留下來以免影響B(tài)m54上下游基因的轉(zhuǎn)錄.
　　 8.Bm54基因敲除后不能產(chǎn)生有感染力的B