家蠶核型多角體病毒ORF79基因(bm79)的結(jié)構(gòu)和蛋白互作分析.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）感染家蠶引起的家蠶血液型膿病是目前蠶絲產(chǎn)業(yè)最為常見和危害嚴(yán)重的蠶病之一，每年對蠶絲業(yè)造成了巨大的損失。隨著1999年BmNPV全基因組序列的測定，其基因功能的研究己成為研究重點。盡管其在侵染過程中發(fā)揮重要作用的相關(guān)基因已陸續(xù)被注釋，但BmNPVORF79(bm79)作為桿狀病毒核心基因之一，它的功能仍然不清楚。因此本文主要對BmNPVORF

2、79基因的結(jié)構(gòu)以及與其他蛋白相互作用做了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.bm79基因克隆及轉(zhuǎn)錄分析
　　 克隆得到的bm79基因位于BmNPVT3株基因組的76132-76678bp，全長549bp，編碼一個含有182個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量約為20.9KD。bm79的起始密碼子ATG上游145bp存在著桿狀病毒的晚期轉(zhuǎn)錄基序TTAAG，終止密碼子TAA的下游74bp和84bp存在轉(zhuǎn)錄終止信號AATAAA。用S

3、ignalIP軟件對基因進(jìn)行信號肽預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在其N端包含一個22個氨基酸殘基的信號肽。同源基因保守性分析結(jié)果表明，bm79蛋白氨基酸序列在已測序的桿狀病毒中高度保守(＞90％)。bm79基因轉(zhuǎn)錄時相分析結(jié)果表明bm79是一個晚期基因，并在感染晚期持續(xù)高量表達(dá)。
　　 2.BM79蛋白表達(dá)及核定位信號鑒定
　　 構(gòu)建BM79的C端融合DsRed熒光蛋白的BM79表達(dá)載體pIZ-DsRed-BM79，以pIZ-DsRed和p

4、IZ-DsRed-PIF3作為對照，轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細(xì)胞后，免疫熒光法檢測BM79蛋白在家蠶細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)BM79蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有分布，而且在細(xì)胞核內(nèi)分布量明顯高于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。另外，在BmNPV病毒感染細(xì)胞的情況下，BM79蛋白分布情況不受影響，說明BM79蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布不受其他病毒因子的影響。進(jìn)一步構(gòu)建BM79蛋白截短多肽表達(dá)載體，免疫熒光檢測結(jié)果表明，BM79蛋白C端Q151-N165氨基酸序列具有核定位功能

5、，指導(dǎo)BM79蛋白由胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)運。
　　 3.BM79蛋白與其他蛋白的相互作用
　　 構(gòu)建BiFC重組病毒vBiFC-BM79-VNVC、vBiFC-BM79-E66、vBiFC-BM79-PIF1、vBiFC-BM79-PIF2和vBiFC-BM79-PIF3，感染BmN-SWU1細(xì)胞后，熒光信號檢測結(jié)果表明，在細(xì)胞中表達(dá)的PIF1、PIF2、PIF3和ODV-E66分別與BM79存在相互作用關(guān)系。進(jìn)一步免疫共沉淀實