dsRNA對(duì)家蠶核多角體病（BmNPV）復(fù)制的抑制作用的研究.pdf

1、由家蠶核多角體病毒(BmNPV)引起的膿病是很常見的蠶病,常常引起蠶業(yè)經(jīng)濟(jì)上很大的損失,因此有效的防治由BmNPV引起的蠶病是一個(gè)急需解決的重要課題,同時(shí)也為研究桿狀病毒提供了模式病毒.RNA干擾(RNA interfering,RNAi)是一種序列特異性的降解靶mRNA的基因調(diào)節(jié)機(jī)制,由于RNAi具有抵抗病毒侵入,抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng),防止自私基因序列的過量增殖等作用,科學(xué)家已開始應(yīng)用RNAi技術(shù)來進(jìn)行人類疾病的探索.該實(shí)驗(yàn)中在國(guó)際上首次應(yīng)

2、用BmNPV來研究RNAi,以BmNPV復(fù)制必需的DNA解旋酶基因和DNA聚合酶基因?yàn)榘行蛄?人工設(shè)計(jì)并合成了長(zhǎng)度分別為435bp(Ap<,1>),300bp(Ap<,2>)和399bp(A<,H>)的三條dsRNAs,利用TransMessenger<'TM> transfection Reagent轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞,研究其對(duì)BmNPV復(fù)制的抑制效果.結(jié)果表明,在野生型病毒BmNPV感染家蠶細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,Ap<,2>和A<,H>這兩個(gè)dsR

3、NA能夠有效的抑制病毒DNA的復(fù)制,并且在轉(zhuǎn)染dsRNA后第四天抑制效果最佳,使病毒滴度(以空斑形成單位PFU/ml值表示)降低了10<'3>~10<'4>倍,而另外一個(gè)dsRNA(Ap<,1>)沒有明顯的抑制效果.DNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果表明作為陽性對(duì)照的正常家蠶細(xì)胞BmN的胞內(nèi)總DNA無雜交信號(hào),而分別轉(zhuǎn)染了A<,p2>和A<,H>的家蠶細(xì)胞其內(nèi)病毒DNA的含量與陰性對(duì)照相比減少了72.3%和63.4%.RT-PCR結(jié)果也表明兩種目的基因

4、在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量在dsRNA的用量為2μg/well時(shí),兩種目的基因(DNApolymerase和DNA helicase)的表達(dá)水下調(diào)了78.27%和86.70%,而其他用量時(shí)目的基因的表達(dá)水平只有略微的變化.此外,該實(shí)驗(yàn)還對(duì)轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性;dsRNA在家蠶細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行了初步的研究.結(jié)果發(fā)現(xiàn)TransMessenger<'TM> transfection Reagen的轉(zhuǎn)染效率為60~70%,當(dāng)用量超過16μl時(shí)

5、,對(duì)家蠶細(xì)胞有毒副作用.用熒光顯微鏡觀察FAM標(biāo)記的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,dsRNA開始越來越多的聚集在細(xì)胞核的周圍,并呈不連續(xù)分布,細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度也越來越強(qiáng).dsRNA在家蠶細(xì)胞中可以維持5天的時(shí)間,但到第6天時(shí)細(xì)胞內(nèi)已檢測(cè)不出熒光信號(hào).綜上所述,通過選擇BmNPV復(fù)制最關(guān)鍵的必需基因作為靶分子,設(shè)計(jì)合成針對(duì)性的dsRNA可以有效的發(fā)揮RNAi作用,抑制病毒DNA的復(fù)制.dsRNA抗BmNPV的可行性為昆蟲