膽汁酸通過(guò)核受體FXR對(duì)胃癌抑制作用的研究.pdf

1、胃癌是世界上第二位高發(fā)、高致死率惡性腫瘤,也是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)生發(fā)展是多個(gè)因素共同作用的結(jié)果,也是一個(gè)相當(dāng)漫長(zhǎng)的演變階段,可能與多種外部因素相關(guān),在此作用下,個(gè)體遺傳素質(zhì)改變,包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、端粒酶的激活、細(xì)胞骨架和黏附分子的改變、生長(zhǎng)因子及其受體改變、DNA修復(fù)基因的異常和積累等,最后細(xì)胞異常增生,腫瘤形成并發(fā)生轉(zhuǎn)移。胃癌還與慢性胃炎、胃息肉、胃粘膜異形增生和腸上皮化生等有一定關(guān)系。
　　

2、 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)深入到分子水平,從中找出有價(jià)值的胃癌診斷標(biāo)記物和治療靶分子是目前胃癌研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　 法尼酯衍生物X受體(FXR)是一種主要在肝及胃腸系統(tǒng)等組織器官表達(dá)的膽汁酸受體,屬于激素核受體超家族的一員,在膽汁酸代謝及膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用。
　　 但FXR的作用遠(yuǎn)不止于代謝調(diào)節(jié)?？偨Y(jié)目前關(guān)于FXR的研究,提示,FXR在膽汁淤積、肝腫瘤、消化道腫瘤等均有保護(hù)作用,但

3、其分子機(jī)制究竟為何,尚未有深入研究。本研究擬針對(duì)FXR在胃癌中的作用機(jī)進(jìn)行初步探討,為FXR和胃癌的相互關(guān)系提供證據(jù)。
　　 第一章FXR在人正常胃、胃癌組織及人胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)目的檢測(cè)FXR在正常胃/胃癌組織,及多種胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。
　　 方法
　　 1.收集德國(guó)慕尼黑工業(yè)大學(xué)伊薩河右岸醫(yī)院(Klinikum rechts der Isar der TUM)2002年～2008年住院部及門(mén)診病例,人正

4、常胃/胃癌組織標(biāo)本,應(yīng)用qPCR、westernblot、免疫組化方法檢測(cè)FXR在人正常胃/胃癌組織的表達(dá)模式。
　　 2.用qPCR和westernblot方法檢測(cè)人胃癌細(xì)胞株AGS、N87、Snu-1、Snu-5、KATO-Ⅲ、MKN7、MKN45中FXR的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.FXR表達(dá)于人正常胃粘膜上皮,而在胃癌上皮中明顯下調(diào)或缺失。
　　 由免疫組化染色可見(jiàn)FXR主要位于非腫瘤性胃腺上皮

5、,核染色為主,還有部分陽(yáng)性染色位于腺體周圍結(jié)締組織。對(duì)于胃癌組織,FXR陽(yáng)性染色明顯減弱,且胞漿染色為主。
　　 選取30例胃癌患者及相應(yīng)正常胃粘膜組織,qPCR分析顯示83.5％(25/30)患者mRNA水平在正常胃粘膜處于較高水平,胃癌組織中下調(diào),具有顯著性差異。
　　 Westernblot分析可見(jiàn)FXR為一分子量為56kD蛋白,正常組織可見(jiàn)清晰強(qiáng)陽(yáng)性條帶,腫瘤組織弱陽(yáng)性或表達(dá)缺失。
　　 2.FXR在絕大

6、部分胃癌細(xì)胞株中缺失。
　　 qPCR分析顯示:胃癌細(xì)胞株AGS、Snul、Snu5、N87、KATO3、MKN7、MKN45中FXR的表達(dá)缺失,HepG2細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照呈高表達(dá)。
　　 Westernblot顯示:FXR在所有胃癌細(xì)胞株中均缺失,肝組織作為陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)濃黑條帶。
　　 結(jié)論
　　 1.FXR在正常胃粘膜表達(dá),在胃癌組織下調(diào)或缺失。
　　 2.FXR在大多數(shù)人胃癌細(xì)胞株缺失。

7、r>　　 第二章異源性FXR增加AGS胃癌細(xì)胞株抗TNFα介導(dǎo)的凋亡作用
　　 目的
　　 以AGS細(xì)胞為代表,建立了FXR-WT/FXR—EV/FXR-DN質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的AGS克隆,通過(guò)一系列細(xì)胞學(xué)檢測(cè),初步闡述FXR在AGS生物學(xué)行為上的分子機(jī)制。
　　 方法
　　 1.根據(jù)lipofectamineTM2000試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方案構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)FXR—WT(FXR野生型)/FXR—EV(FXR空載質(zhì)粒)/

8、FXR—DN(FXR顯性失活)的AGS克隆。
　　 2.通過(guò)FXR配體鵝去氧膽酸(CDCA),及凋亡誘導(dǎo)劑TNFα+CHX處理AGS細(xì)胞,建立不同AGS克隆凋亡模型。
　　 3.MTT法繪制TNFα+CHX誘導(dǎo)的凋亡曲線。
　　 4.RT-qPCR鑒定FXR在AGS克隆的表達(dá)。
　　 5.Westerblot鑒定FXR在AGS克隆的表達(dá)及TNFα+CHX誘導(dǎo)AGS克隆凋亡Caspase-8/Caspase

9、-3/PARP的表達(dá)。
　　 6.熒光倒置顯微鏡檢測(cè)TNFα+CHX誘導(dǎo)凋亡的AGS細(xì)胞7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同AGS克隆在TNFα+CHX誘導(dǎo)下的凋亡。
　　 8.RNA干擾結(jié)果1.成功建立FXR-WT/FXR-EV/FXR-DN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的AGS克隆細(xì)胞系,并用qPCR及westernblot檢測(cè)FXR在AGS克隆的穩(wěn)定表達(dá)。
　　 2.MTT法檢測(cè)FXR在AGS克隆的抗凋亡作用。無(wú)FXR配體CDCA共處理的凋亡

10、誘導(dǎo),隨著TNFα+CHx濃度的增加,WT克隆存活率明顯大于EV克隆和DN克隆。有FXR配體CDCA共處理的凋亡誘導(dǎo),以不同濃度TNFα+CHX處理AGS克隆24小時(shí),隨著TNFα+CHX濃度的增加,可見(jiàn)WT克隆存活率明顯大于EV克隆和DN克隆,且WT克隆存活率較沒(méi)有CDCA共處理的WT克隆存活率更高。CDCA50uM能最大限度保護(hù)FXR—WT AGS細(xì)胞。
　　 3.根據(jù)前面結(jié)果,選擇TNFα100ng/ml+CHX20ug/

11、ml這一濃度,用westernblot觀察不同曝露時(shí)間下AGS克隆凋亡酶Caspase及其底物PARP的表達(dá)情況。FXR-EV/FXR-WT的凋亡產(chǎn)物都隨處理時(shí)間增加而增加,且FXR-EV克隆凋亡產(chǎn)物表達(dá)量較FXR-WT明顯增加。
　　 4.熒光倒置顯微鏡檢測(cè)Annexin-V-FLUOS染色的AGS FXR-WT/FXR-EV凋亡細(xì)胞。AGS克隆在用TNFα100ng/ml+CHX20ug/ml處理細(xì)胞24小時(shí),誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡細(xì)

12、胞,采用Annexin-V-FLUOS/PI雙染色,并用熒光倒置顯微鏡鏡檢,確認(rèn)AGS FXR—EV較AGS FXR—WT出現(xiàn)更多凋亡細(xì)胞。
　　 5.流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)AGS FXR-WT/FXR-EV凋亡細(xì)胞。精確計(jì)數(shù)AGSFXR-WT/FXR—EV細(xì)胞在TNFα+CHX誘導(dǎo)下凋亡程度的差別,利用流式細(xì)胞儀,采取Annexin-V-FLUOS/PI雙染色,計(jì)算(凋亡細(xì)胞/50000細(xì)胞)比率,發(fā)現(xiàn)FXR-EV細(xì)胞較FXR—WT細(xì)

13、胞出現(xiàn)更多凋亡細(xì)胞,具有顯著性差異。
　　 6.MTT法檢測(cè)siRNA干擾的AGS FXR-WT克隆凋亡情況。運(yùn)用RNA干擾技術(shù)處理AGS FXR—WT克隆,沉默F(xiàn)XR基因,經(jīng)檢測(cè),基因沉默效果較好,經(jīng)過(guò)RNA干擾,FXR基因沉默的AGS FXR.WT克隆凋亡率明顯高于未經(jīng)過(guò)干擾的AGS FXR-WT克??；在兩者經(jīng)過(guò)同樣的FXR配體CDCA處理以后,CDCA在未經(jīng)干擾的AGS FXR-WT克隆顯示出其對(duì)凋亡的保護(hù)作用,而在FXR

14、基因沉默的克隆未顯示出相似作用。
　　 結(jié)論
　　 1.通過(guò)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FXR-WT/FXR-EV/FXR-DN的AGS克隆,可以研究0FXR在胃癌細(xì)胞株中的生物學(xué)行為。
　　 2.異源性FXR在AGS胃癌細(xì)胞株中有抗TNFα+CHX誘導(dǎo)凋亡的作用,這一作用有可能減少炎癥引起的細(xì)胞損傷,起遠(yuǎn)期抑癌作用。
　　 第三章FXR的激活上調(diào)靶基因CK13的表達(dá)
　　 目的
　　 應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩

15、選出可能介導(dǎo)FXR抗凋亡的基因CK13,并從mRNA和蛋白水平上確認(rèn)了FXR激活對(duì)CK13的上調(diào)作用。檢測(cè)了人正常胃/胃癌組織CK13的表達(dá),并以胃癌細(xì)胞株AGS和FXR—KO小鼠為模型,從體內(nèi)外兩方面闡述了FXR對(duì)CK13基因的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 方法
　　 1.AGS克隆基因表達(dá)譜的基因芯片分析,根據(jù)Affymetrix GeneChip(R)GeneExpression Analysis Technical M

16、anual標(biāo)準(zhǔn)方案。
　　 2.RT-qPCR鑒定CK13在AGS克隆、小鼠胃組織、人正常胃/胃癌組織中的表達(dá)。
　　 3.westerblot鑒定CK13在AGS克隆、小鼠各器官組織、人正常胃/胃癌組織中的表達(dá)。
　　 4.CK13在FXR-WT/FXR-KO小鼠胃組織的免疫組化染色。
　　 5.ChIP,根據(jù)ChIP Assay Kit(Upstate)標(biāo)準(zhǔn)方案。
　　 6.EMSA
　

17、　 結(jié)果
　　 1.基因芯片表達(dá)譜分析及挑選介導(dǎo)FXR激活抗凋亡作用的候選基因以CDCA100uM/DMSO處理AGS FXR—WT/FXR-EV16小時(shí)后,根據(jù)基因芯片分析結(jié)果挑選出FXR候選靶基因CK13。
　　 2.FXR激活誘導(dǎo)CK13表達(dá)上調(diào)2.1基因芯片F(xiàn)XR依賴基因表達(dá)譜變化的qPCR分析作為FXR的經(jīng)典靶基因OSTalpha和IBABP,經(jīng)FXR配體CDCA刺激后,AGS FXR-WT都有不同程度的上調(diào)

18、,而AGS FXR—EV/AGS FXR—DN則基本沒(méi)有變化,HepG2是陽(yáng)性對(duì)照。由此可確知FXR依賴性的CDCA的配體激活作用。經(jīng)qPCR檢測(cè),CDCA誘導(dǎo)AGS FXR—WT中CK13的上調(diào)與基因芯片的結(jié)果吻合。
　　 2.2 CDCA通過(guò)FXR上調(diào)AGS FXR-WT細(xì)胞CK13表達(dá)是濃度依賴性CDCA處理AGS克隆24d小時(shí),濃度分別為0,25,50,75,100uM。經(jīng)qPCR檢測(cè),AGS FXR—WT細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的

19、CK13 mRNA上調(diào),呈CDCA濃度依賴性,而AGS FXR-EV/FXR-DN細(xì)胞無(wú)明顯變化。經(jīng)westernblot檢測(cè),AGS FXR-WT細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的CK13蛋白上調(diào),呈CDCA濃度依賴性,而AGS FXR-EV/FXR-DN細(xì)胞無(wú)明顯變化。
　　 2.3 CDCA通過(guò)FXR在小鼠胃組織上調(diào)CK13 mRNA表達(dá)為進(jìn)一步探討CDCA通過(guò)FXR誘導(dǎo)的CK13在體內(nèi)的表達(dá)模式,用含有(1％CDCA+Zn)的飼料喂養(yǎng)C57

20、BU6野生型(n=5)和FXR-KO小鼠(n=5)7天及8周,提取其胃組織mRNA,經(jīng)qPCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)CK13 mRNA在C57BL/6野生型表達(dá)上調(diào),短期(7天)或長(zhǎng)期(8周)有相似反應(yīng),短期反應(yīng)更顯著,但在FXR-KO小鼠基本沒(méi)有改變。除此之外,對(duì)小鼠其他器官如肝、食管和結(jié)腸FXR經(jīng)典靶基因的qPCR檢測(cè)(SHP、Cyp7A、IBABP等)顯示,Cyp7A在肝外器官低表達(dá),且對(duì)CDCA刺激無(wú)反應(yīng)；但I(xiàn)BABP在C57BL/6野生型

21、小鼠結(jié)腸、食管和胃的表達(dá)顯著性上調(diào),在FXR-KO小鼠無(wú)改變,顯示出CDCA可以引發(fā)系統(tǒng)性的肝外的FXR依賴反應(yīng)。
　　 3.CK13在C57BL/6野生型和FXR-KOd,鼠器官的表達(dá)模式為了觀察CK13在小鼠其他器官的表達(dá)模式是否與FXR相關(guān),我們檢測(cè)了C57BL/6野生型和FXR-KO小鼠不同器官的CK13 mRNA和蛋白水平。CK13在C57BL/6野生型小鼠各器官均有表達(dá),在FXR-KOd小鼠低表達(dá)或缺失。免疫組化染色

22、顯示胃腺和胃食管連接處鱗狀上皮的CK13陽(yáng)性染色。CK13主要表達(dá)于胃上皮細(xì)胞周圍的纖維母細(xì)胞,提示其作為細(xì)胞骨架蛋白,在細(xì)胞連接、穩(wěn)定的作用。
　　 4.CK13在人正常胃/胃癌組織中的表達(dá)在確認(rèn)胃癌細(xì)胞株和FXR-KO小鼠CK13下調(diào)以后,接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了CK13在人正常胃/胃癌組織中的表達(dá)。并在mRNA、蛋白水平闡明,CK13與FXR的變化模式一致,表達(dá)于正常胃黏膜上皮,在胃癌組織中下調(diào)或缺失。
　　 qPCR結(jié)

23、果顯示:CK13 mRNA在胃癌組織下調(diào),與正常胃黏膜相比有顯著性差異,在30病例中,80％(24/30)符合上述模式。
　　 westernblot檢測(cè):從代表性病例中可見(jiàn),CK-13蛋白表達(dá)與m RNA的趨勢(shì)一致,在人正常胃組織中高表達(dá),在胃癌組織下調(diào)或缺失。
　　 免疫組化顯示:CK13典型陽(yáng)性染色為細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),因其為細(xì)胞內(nèi)的中等纖維,故在呈現(xiàn)為細(xì)胞骨架。在彌漫性胃癌組織內(nèi),CK13陽(yáng)性染色減弱。值得一提的是,

24、在腸上皮化生的示范染色中,可見(jiàn)殘留正常腺體CK13染色陽(yáng)性,而在化生病灶中,CK13染色陰性,充分說(shuō)明在正常至癌變的過(guò)渡中,CK13趨向于下調(diào)。
　　 5.CK13的定量ChIP在本實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用FXR多抗(H-130,Santa Cruz Biotech)作為抗體,CK13的DNA純化片段用qPCR擴(kuò)增,CT值用b2m標(biāo)化,直接比較AGS FXR—WT/FXR—EV的免疫沉淀產(chǎn)物。qPCR產(chǎn)物并用瓊脂糖電泳顯示。AGS FXR-

25、WT克隆CK13基礎(chǔ)表達(dá)量較AGS FXR—EV克隆CK13基礎(chǔ)表達(dá)量高,且經(jīng)過(guò)FXR配體CDCA刺激后,AGS FXR-WT克隆CK13表達(dá)量明顯上調(diào),而AGS FXR—EV克隆無(wú)明顯變化。
　　 6.熒光素酶活性檢測(cè)我們將含有CK13啟動(dòng)子的報(bào)道基因CK13 promoter pGL3-basic—luciferasevector或FXR-RE pTK-luc和FXR—WT或EV共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞,并用50μM和100

26、μM CDCA處理24小時(shí)后觀察熒光素酶活性的變化。CDCA處理FXR-WT轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞后引起CK13啟動(dòng)子pGL3-luc的熒光素酶活性明顯升高,而EV轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞在CDCA處理后報(bào)道基因熒光素酶的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化,作為陽(yáng)性對(duì)照,FXR-REpTK-luc轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性在FXR激活后呈CDCA濃度依賴性的升高。
　　 7.MTT法檢測(cè)CK13 siRNA干擾的AGS FXR—WT克隆

27、凋亡情況為進(jìn)一步明確CK-13在AGS克隆凋亡中所起的作用,我們運(yùn)用RNA干擾技術(shù)處理AGS FXR-WT克隆,沉默F(xiàn)XR基因。圖3-13右側(cè)的小圖(qPCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳)顯示RNA干擾的效能,RNAi處理的克隆CK13表達(dá)明顯減弱。
　　 經(jīng)過(guò)CK13 RNA干擾,CK13基因沉默的AGS FXR—WT克隆凋亡率明顯高于未經(jīng)過(guò)干擾的AGS FXR-WT克??；在兩者經(jīng)過(guò)同樣的FXR配體CDCA處理以后,CDCA在未經(jīng)干擾的AG

28、S FXR-WT克隆顯示出其對(duì)凋亡的保護(hù)作用,而在CK13基因沉默的克隆未顯示出相似作用。
　　 8.EMSA檢測(cè)FXR在CK13基因上的結(jié)合位點(diǎn)我們應(yīng)用EMSA檢測(cè)FXR是否直接與CK13基因元件結(jié)合。FXR-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,首先應(yīng)用western blotting確認(rèn)了轉(zhuǎn)染和核蛋白的提取的成功。經(jīng)過(guò)分析,我們篩選出一些FXR在CK13基因上的可能結(jié)合位點(diǎn),即VDR和RARE—1,2,3。
　　 EMS

29、A的結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染了FXR-WT質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞的核蛋白對(duì)FXR IR-1寡核苷酸探針的結(jié)合明顯增加,此結(jié)合被200倍過(guò)量的未標(biāo)記RARE-3寡核苷酸探針顯著競(jìng)爭(zhēng)抑制,而200倍過(guò)量的未標(biāo)記寡核苷酸探針RARE-3(MUT)未引起結(jié)合的顯著降低。
　　 結(jié)論
　　 1.胃癌AGS細(xì)胞株及小鼠、人胃組織CK13基因的表達(dá)上調(diào)依賴于FXR的激活。
　　 2.FXR激活可能通過(guò)CK