脯氨酸羥化酶3對胃癌的抑制作用及其機制研究.pdf

1、研究背景:胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，全世界約有40％的胃癌病例發(fā)生在我國。近年來發(fā)病率雖略有下降，但總體療效并未獲得明顯改善，而對胃癌發(fā)病機制的探討，無疑將為其臨床治療提供新的理論依據。已經證明，胃癌的發(fā)生是一個多因素，多步驟的長期過程，涉及到一系列原癌基因的激活，和抑癌基因突變導致的失活，闡明這些基因在胃癌形成中的作用具有重要意義。
　　脯氨酸羥化酶(Prolyl hydroxylase domain protein，PH

2、Ds)被認為是一種腫瘤抑制因子，對PHDs在腫瘤中作用的研究也取得了一定進展，其中的脯氨酸羥化酶3(PHD3)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系更倍受關注，已成為研究熱點。最近，我們通過檢索美國NCI數據庫并委托查新檢索，發(fā)現國內外尚未有關PHD3與胃癌關系的深入研究報道。PHD3在胃癌進程中的作用及相關作用機制都還不明確，值得進一步探索。
　　目的:檢測PHD3在人胃癌細胞系(AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-79

3、01和MKN-45)、人正常胃上皮細胞GES及人胃癌組織的表達，探討PHD3對人胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響。
　　方法:
　　1、胃癌組織及胃癌細胞株中PHD3表達
　　Real-time PCR法檢測新鮮胃癌組織及配對的癌旁非腫瘤胃粘膜中PHD3的表達。Real-time PCR法檢測本實驗室儲存的胃癌細胞株(AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-7901和MKN-45)及人正常胃上皮細胞G

4、ES中PHD3的表達情況。
　　免疫組化法檢測100例胃癌組織和對應的癌旁“正?！苯M織的PHD3表達，收集胃癌的臨床病理資料，分析PHD3表達與胃癌臨床病理因素（如腫瘤大小、浸潤深度、病理學類型、分化程度、有無淋巴結轉移或遠處轉移、TNM分期以及生存期等）的關系。
　　2、PHD3對胃癌細胞生物學作用研究
　　構建pYr-1.1-EGLN3-shRNA真核表達載體（PHD3又稱EGLN3），并轉染胃癌細胞。通過RT-Q

5、PCR、Western-Blot檢測，成功獲得PHD3表達最低的實驗（BGC-823-shEGLN3、AGS-shEGLN3）和表達最高的陰性對照組(BGC-823-EGFP-shNC、AGS-EGFP-shNC)細胞。
　　觀察轉染后腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力等一系列體外實驗的變化。
　　①增殖試驗:檢測轉染前后的腫瘤細胞在0，24h，48h，72h各個時段的細胞增殖情況，并繪制成增殖曲線。
　?、谶w移侵襲實驗:

6、用Transwell小室作為腫瘤細胞體外遷移和侵襲實驗的模型，在上室表面鋪或不鋪Matrigel，并于上室中加入2×106 Cell/ml個轉染前后的腫瘤細胞，下室加入含3T3細胞培養(yǎng)上清液，觀察下調PHD3表達對腫瘤細胞遷移侵襲能力的影響。
　　結果:與癌旁非腫瘤胃粘膜相比，胃癌組織內PHD3表達下調，57％的(57/100)胃癌患者呈PHD3低表達。PHD3的表達強度與腫瘤大小、Lauren分型、浸潤深度、淋巴結轉移、淋巴結轉

7、移分期負相關。PHD3低表達患者生存時間較高表達患者短，5年生存率低，但差異無統(tǒng)計學意義。
　　PHD3在人胃癌細胞株AGS、MKN-28、BGC-823、HCG-27、SGC-7901和MKN-45的表達量顯著低于人正常胃上皮細胞GES的表達量。
　　人胃癌細胞株BGC-823和AGS轉染PHD3抑制表達載體（pYr-1.1-EGLN3-shRNA）24小時后，經RT-PCR、western-blot驗證目的基因EGLN3

8、表達產物PHD3含量降低。轉染PHD3抑制載體48小時、72小時后，實驗組（pYr-1.1-EGLN3-shRNA）的BGC-823和AGS的增殖率顯著高于陰性對照組（pYr-1.1-EGFP-nc）。實驗組BGC-823細胞遷移數顯著多于陰性對照組，差異具有顯著性;而在AGS細胞，實驗組與陰性對照組相比，透過膜的細胞數量無明顯增加。人胃癌細胞株BGC-823和AGS轉染后，做侵襲實驗，48小時后HE染色觀察結果，BGC-823細胞實驗

9、組穿過QCM ECMatrix Cell Invasion Assay膜的數量較陰性對照組顯著增加，AGS細胞實驗組較陰性對照組，細胞透膜數量無明顯增多。
　　結論:
　　1.與癌旁非腫瘤胃粘膜相比，胃癌組織內PHD3在轉錄和翻譯水平均表現為表達下降。
　　2.人胃癌組織內PHD3表達強度，與Lauren分型、腫瘤大小，浸潤深度、淋巴結轉移數量相關。低表達患者，腫瘤侵襲能力高，生存時間短。
　　3.PHD3在人胃