脯氨酸羥化酶PHD2在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、脯氨酸羥化酶蛋白家族(PHDs)是位于細(xì)胞內(nèi)的氧含量感應(yīng)蛋白，是可直接感受氧分壓變化的分子，其活性的發(fā)揮嚴(yán)格依賴于細(xì)胞內(nèi)的氧分壓。PHD2是PHDs家族中重要的氧感受器，廣泛表達(dá)于上皮來(lái)源的組織中，是細(xì)胞內(nèi)重要的氧/氧化還原敏感的蛋白酶。在氧分壓正常的條件下，PHD2可通過(guò)氧依賴性的途徑使缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在蛋白酶體內(nèi)快速的降解。在缺氧的條件下，PHD2降解HIF-

2、1α活性受到抑制，形成缺氧反應(yīng)調(diào)節(jié)通路，產(chǎn)生各種缺氧相關(guān)蛋白，維持細(xì)胞的能量代謝。
　　缺氧是包括肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤廣泛存在的特征，既往研究主要集中在HIF-1介導(dǎo)的多種基因的轉(zhuǎn)錄激活，以及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，PHD2活性的改變才是腫瘤細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)缺氧反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)。在許多腫瘤中，都可檢測(cè)到PHD2的異常表達(dá)，但關(guān)于PHD2在腫瘤進(jìn)展中的作用目前尚未

3、達(dá)成共識(shí)。各種相關(guān)研究常常得出互相矛盾的結(jié)論，其既有可能通過(guò)降解HIF-1α發(fā)揮抑癌的作用，亦有可能通過(guò)其他途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展。PHD2在HCC中的研究報(bào)道較少，其表達(dá)情況與HCC患者預(yù)后的關(guān)系，以及可能的機(jī)制尚不十分清楚。
　　本課題擬從以下兩個(gè)部分進(jìn)行研究，第一部分首先檢測(cè)PHD2在HCC組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析其與HCC患者預(yù)后的關(guān)系;第二部分通過(guò)體內(nèi)、體外的

4、實(shí)驗(yàn)研究PHD2對(duì)HCC生物學(xué)行為的影響并探討可能的分子機(jī)制。以期為HCC患者提供一個(gè)評(píng)價(jià)預(yù)后的指標(biāo)，為HCC的臨床治療研究提供一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。
　　第一部分:PHD2在HCC組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系
　　目的：
　　檢測(cè)PHD2在HCC組織標(biāo)本中的表達(dá)量，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析其與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：
　　首先通過(guò)免疫組化(IHC)的方法分別對(duì)20例正常肝組織、20例HCC癌組織中PHD2表

5、達(dá)量進(jìn)行檢測(cè);再進(jìn)一步檢測(cè)并分析220例HCC患者組織標(biāo)本中PHD2表達(dá)與HCC的臨床病理特征之間的關(guān)系;隨訪220例HCC患者并記錄每個(gè)患者的生存時(shí)間，然后對(duì)PHD2的表達(dá)量與HCC患者的預(yù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪制生存曲線，進(jìn)行多因素回歸分析，了解PHD2與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，HCC中PHD2的蛋白表達(dá)量明顯升高。
　　2、采用IHC技術(shù)對(duì)220例HCC病例樣本

6、進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)分，結(jié)果提示PHD2的高表達(dá)與腫瘤體積較大、分化程度較低、TNM分期較晚、高水平的甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）顯著相關(guān)。
　　3、對(duì)隨訪資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn):與PHD2低表達(dá)組HCC患者相比，PHD2高表達(dá)患者的術(shù)后無(wú)病生存時(shí)間（(25.5±3.6月vs.16.7±3.4月，log-rank，P＜0.001)及總生存時(shí)間（37.5±3.6月 vs.29.5±4.7月，log-rank test，

7、P＜0.001）均較短，通過(guò)多因素分析發(fā)現(xiàn)PHD2表達(dá)水平、血清AFP水平、腫瘤大小、病理分期是影響HCC患者生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。
　　第二部分：PHD2對(duì)HCC生物學(xué)行為的影響及機(jī)制探討
　　目的：
　　研究PHD2對(duì)HCC生物學(xué)行為的影響并探討相關(guān)分子機(jī)制
　　方法：
　　應(yīng)用Western-blot檢測(cè)3株HCC細(xì)胞(QGY7703， Be17404， Hep3B)正常肝細(xì)胞系L02中PHD2的表達(dá)水

8、平;利用RNA干擾技術(shù)，分別選擇PHD2 siRNA和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染三株HCC細(xì)胞，采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)HCC細(xì)胞株 PHD2被沉默的效果，MTT法檢測(cè)每株HCC細(xì)胞的增殖情況，transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)每株HCC細(xì)胞侵襲力和遷移力，采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)每株HCC細(xì)胞的凋亡情況，應(yīng)用Hep3B細(xì)胞株，建立HCC裸鼠移植瘤模型，建立模型成功后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組，PHD2沉默組利用瘤體內(nèi)注射的方式將膽固醇修飾的PH

9、D2 RNAi注射入瘤體內(nèi)，同時(shí)設(shè)立空白組（不做處理）和生理鹽水對(duì)照組（注射生理鹽水）進(jìn)行對(duì)照研究，每4天注射一次，觀察并記錄裸鼠的瘤體生長(zhǎng)變化情況，開(kāi)始注射藥物后第16天處死裸鼠，采集瘤體標(biāo)本用Western Blot技術(shù)檢測(cè)了PHD2、p-sMAD2/3及癌基因c-myc的表達(dá)情況;采用IHC技術(shù)檢測(cè)220例HCC臨床標(biāo)本中c-Myc的表達(dá)，分析其與PHD2以及HCC患者臨床病理特征的相關(guān)性，
　　結(jié)果：
　　1、體外細(xì)

10、胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與正常肝細(xì)胞株相比，癌細(xì)胞株P(guān)HD2的表達(dá)明顯升高。采用PHD2 RNAi干擾后，與陰性對(duì)照siRNA組相比，三個(gè)HCC細(xì)胞株的增殖(P＜0.05)、侵襲力與遷移力都有顯著性下降(P＜0.05)，凋亡增加(P＜0.05)。
　　2、在HCC裸鼠移植瘤模型中PHD2沉默組裸鼠瘤體增長(zhǎng)緩慢（P＜0.05）。瘤體標(biāo)本中PHD2沉默組p-SMAD2/3表達(dá)水平明顯高于空白組和對(duì)照組(P＜0.05)，而PHD2沉默組c-My

11、c的表達(dá)水平明顯低于其他兩組(P＜0.05)。
　　3、IHC術(shù)檢測(cè)220例HCC臨床標(biāo)本中c-Myc的表達(dá)，c-Myc的高表達(dá)與腫瘤體積較大、分化程度較低、TNM分期較晚、高水平的甲胎蛋白顯著相關(guān)，與PHD2的表達(dá)也顯著相關(guān)(r=0.557，P＜0.001)
　　結(jié)論:
　　1、PHD2的高表達(dá)與HCC患者較差的預(yù)后密切相關(guān)。
　　2、HCC細(xì)胞株中PHD2表達(dá)增高;PHD2的高表達(dá)可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、遷