hTERT啟動子調(diào)控PE38KDEL基因載體的構(gòu)建及其在MiaPaCa2細胞中的表達.pdf

1、目的： 人胰腺癌是臨床常見高度惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，手術(shù)可切除率在10％左右，以手術(shù)為主的綜合治療手段效果不好，術(shù)后轉(zhuǎn)移早，其中位生存時間不足5個月，五年生存率小于5％；而在不可切除的病例中，化療和放療副反應(yīng)大。因此，提高治療效果，探索胰腺癌的基因治療有重要意義。然而基因治療的療效并不令人滿意，原因是多方面的，其中轉(zhuǎn)移基因在靶細胞組織或器官中表達的時空特異性、基因治療載體的安全性等問題嚴重影響了此項工作的進展。

2、 端粒酶是一個核糖蛋白復(fù)合體，它的功能是給染色體末端加入重復(fù)序列（TTAGGG）n，眾所周知，它在細胞永生化中發(fā)揮著重要作用。端粒酶在很多腫瘤細胞中呈現(xiàn)陽性，而在正常細胞端粒酶則呈陰性。在端粒酶3個必需組成部分中，端粒酶催化亞單位（telomerase catalytic subunit，hTERT）只在腫瘤細胞中表達，利用hTERT啟動子調(diào)控目的基因靶向表達有望成為靶向基因治療的重要手段。 銅綠假單胞菌外毒素（Pseud

3、omonas exotoxin A，PE）是由銅綠假單胞菌分泌，分子量約為66000的一條單鏈多肽，由613個氨基酸組成，其毒性強烈。PE作為新型的導(dǎo)向性藥物－免疫毒素（Immunotoxins，ITs）的毒素分子在生物治療中顯示了其良好的殺傷效果。PE38KDEL是截短了的PE，其分子量較PE小，免疫原性較PE低，其毒性較較PE提高了6～10倍。 以PE38KDEL毒素為“導(dǎo)彈”，以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Human Telomer

4、ase Reverse Transcriptase，hTERT）啟動子為腫瘤靶向啟動子，構(gòu)建真核表達載體phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP，使EGFP和PE38KDEL在具有端粒酶活性的人胰腺癌細胞MiaPaCa2中特異性表達。 方法： 從含hTERT啟動子序列的重組質(zhì)粒pGL3-hTERTp上，PCR得到約280 bp的核心啟動子片段，以之取代pIRES2-EGFP中的CMV啟動子，然后將PE38K

5、DEL亞克隆到pHTERT-IRES2-EGFP的多克隆位點（MCS）中，構(gòu)建phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP真核表達載體。用含有巨細胞病毒（CMV）啟動子的質(zhì)粒pIRES2-EGFP作為陽性對照，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞MiaPaCa2，人胚肺成纖維細胞Wi-38，熒光顯微鏡下觀察各細胞中EGFP轉(zhuǎn)錄表達情況。 結(jié)果： 雙酶切及測序均證實真核表達載體phTERTp-PE38KEDL-IRE

6、S2-EGFP構(gòu)建成功。細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染了pIERS2-EGFP質(zhì)粒的MiaPaCa2、Wi-38、細胞中EGFP都有不同程度的表達：轉(zhuǎn)染phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP質(zhì)粒的MiaPaCa2人胰腺癌細胞中可清晰地觀察到EGFP強熒光表達，而Wi-38細胞中無熒光表達。 結(jié)論： hTERT啟動子能調(diào)控PE38KDEL及EGFP在胰腺癌細胞特異性表達。CMV啟動子調(diào)控的EGFP在胰腺癌細胞和正