小鼠UHS啟動子-蜘蛛拖絲蛋白基因表達載體構(gòu)建及其在體細胞中整合.pdf

1、為了建立通過哺乳動物被毛獲取蜘蛛絲的方法,本研究以小鼠為動物模型,利用研究室前期工作中獲得的蜘蛛拖絲蛋白二聚體、小鼠皮膚特異性啟動子UHS和構(gòu)建的UHS-2S-3.1重組質(zhì)粒.構(gòu)建在機體中廣泛表達的CMV-2S-pIRES2-EGFP質(zhì)粒和在皮膚上特異表達且可通過報告基因GFP便于檢測的UHS-2S-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒,分別在轉(zhuǎn)染小鼠顆粒細胞和小鼠胎兒皮膚成纖維細胞基礎上,通過G418篩選并經(jīng)PCR法鑒定,檢測其在基因組中整

2、合情況。其結(jié)果:
　　 (1)蜘蛛拖絲蛋白基因真核表達載體的構(gòu)建:將二聚化拖絲蛋白基因與載體pIRES2-EGFP相連接,獲得表達載體CMV-2S-pIRES2-EGFP;通過特異性引物將角蛋白啟動子UHS擴增,連接到切除自身CMV病毒啟動子的CMV-2S-pIRES2-EGFP載體上,獲得拖絲蛋白基因真核表達載體UHS-2S-pIRES2-EGFP。
　　 (2)顆粒細胞的轉(zhuǎn)染與篩選:利用幼鼠顆粒細胞,通過體外培養(yǎng),可

3、獲得最佳的原代貼壁時間、傳代速率、細胞形態(tài)和冷凍復蘇后活性等指標的細胞株;用線性化的UHS-2S-3.1載體轉(zhuǎn)染到顆粒細胞后,經(jīng)13418篩選并通過PCR鑒定證實,細胞基因組中整合含有UHS-2S-3.1。
　　 (3)成纖維細胞的轉(zhuǎn)染與篩選:采用常規(guī)方法建立小鼠皮膚成纖維細胞系;用線性化的CMV-2S-pIRES2-EGFP以及UHS-2S-pIRES2-EGFP載體轉(zhuǎn)染成纖維細胞并進行G418抗性篩選擴增的陽性細胞,經(jīng)對其基