αA晶體蛋白基因啟動(dòng)子與HSP70基因融合表達(dá)載體構(gòu)建及其在半乳糖誘導(dǎo)大鼠晶狀體組織的表達(dá).pdf

1、目的:構(gòu)建αA晶體蛋白基因啟動(dòng)子（αACP）與HSP70基因融合表達(dá)載體pαACP-HSP70，并檢測(cè)其在半乳糖誘導(dǎo)的大鼠晶狀體組織的表達(dá)及其對(duì)半乳糖誘導(dǎo)大鼠晶狀體組織抗氧化系統(tǒng)的作用。
　　 方法:利用PCR技術(shù)從pIRES2-EGFP-HSP70中擴(kuò)增HSP70，用XhoⅠ和BamH I分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和pαACP-IRES2-EGFP載體，回收目的片段再連接構(gòu)建αACP啟動(dòng)子啟動(dòng)的含HSP70基因的特異性表達(dá)載體pαACP

2、-HSP70，通過酶切、PCR檢測(cè)及測(cè)序證實(shí)其構(gòu)建成功。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-HSP70、pαACP-HSP70分別導(dǎo)入半乳糖誘導(dǎo)的大鼠晶狀體組織，以生理鹽水作為空白對(duì)照。通過熒光顯微鏡直接觀察綠色熒光蛋白基因(EGFP)的表達(dá)，western blot檢測(cè)HSP70基因在大鼠晶狀體組織中的表達(dá);用SOD試劑盒及GSH-Px試劑盒分別檢測(cè)晶狀體抗氧化系統(tǒng)中SOD、GSH-Px活性的變化。<

3、br>　　 結(jié)果:(1)構(gòu)建的pαACP-HSP70質(zhì)粒通過酶切圖譜鑒定、PCR檢測(cè)有1924bp條帶出現(xiàn)，通過測(cè)序顯示所克隆的HSP70基因與基因庫中的同種序列比較，核苷酸序列有100％的同源性。(2) pIRES2-EGFP組、pHSP70組、pαACP-HSP70組在大鼠晶狀體組織均可直接觀察到綠色熒光，且pαACP-HSP70組熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，與pIRES2-EGFP組、pHSP70組的差異均有顯著性(P＜0.01)，NS組未見

4、熒光蛋白表達(dá)。(3) western blot檢測(cè)顯示外源性HSP70基因可在大鼠晶狀體組織表達(dá)。(4)在高糖刺激下晶狀體中SOD及GSH-Px活力明顯下降，pαACP-HSP70組與其他組相比SOD、GSH-Px的活性顯著升高(P＜0.01)，與NS組比較分別增加了1.41倍和13.65倍。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了晶狀體上皮細(xì)胞特異性表達(dá)載體pαACP-HSP70;該表達(dá)載體導(dǎo)入大鼠晶狀體組織內(nèi)可表達(dá)外源性HSP70基因;外源