hTERT啟動子調(diào)控TRAIL基因表達(dá)載體誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。近年來，隨著社會生活的變化，宮頸癌發(fā)病的年輕化和腺癌比例增加等都給宮頸癌的診治提出了新的問題和面臨著新的挑戰(zhàn)。為此，人們致力于探索提高宮頸癌治療效果的方法。 hTERT (human telmoerase reserse transcriptase)是人端粒酶活性的中心，是最重要、最普遍的腫瘤特異性的生化標(biāo)志之一。端粒酶的活化是細(xì)胞永生化和癌變的重要因素。TRAIL (Tumor necrosi

2、s factor related apoptosis-inducingligand)是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，能選擇性介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對正常組織和細(xì)胞無損傷，其抗腫瘤的優(yōu)勢已受到研究者的廣泛重視。本實(shí)驗(yàn)旨在探討端粒酶（hTERT）啟動子驅(qū)動的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）對宮頸癌細(xì)胞的生長抑制作用，以及與放化療聯(lián)合在避免損傷正常細(xì)胞，靶向腫瘤及提高特異性治療中的作用。 目的: 探討腫瘤壞死因子相關(guān)配體

3、（TRAIL）在宮頸癌組織的表達(dá)情況；探討hTERT 啟動子調(diào)控TRAIL 的基因表達(dá)載體對宮頸癌細(xì)胞株HeLa 和SiHa 的生長抑制，對細(xì)胞生長周期、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為的影響；觀察聯(lián)合放化療對細(xì)胞的生長抑制、誘導(dǎo)凋亡的作用以及對細(xì)胞成瘤性的影響，進(jìn)一步探討hTERT 啟動子調(diào)控TRAIL 與宮頸癌的關(guān)系，為宮頸癌的治療及預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（SABC），檢測49 例宮頸癌組織、10

4、例宮頸上皮內(nèi)瘤變中TRAIL 和死亡受體DR4、DR5 的表達(dá)，及其與宮頸癌的病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 2. 用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染真核基因表達(dá)載體hTERTpromoter-pIRES2-EGFP 和CMVpromoter-pIRES2-EGFP 等,G418 篩選，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞組RT-PCR檢測TRAILmRNA 的表達(dá)情況；免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白GFP/TRAIL 的表達(dá)情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測

5、轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體hTERT-TRAIL 和CMV-TRAIL 對細(xì)胞凋亡的作用； MTT 法觀察轉(zhuǎn)染真核基因表達(dá)載體hTERT-TRAIL 和CMV-TRAIL 對細(xì)胞增殖能力的影響；透射電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染hTERT -TRAIL 細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。 3．采用MTT 法，觀察轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性及對細(xì)胞增殖能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析聯(lián)合化療藥物對轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期的作用。 4．分別用MTT、流式細(xì)胞

6、術(shù)觀察轉(zhuǎn)染hTERT-TRAIL 聯(lián)合放化療后，對細(xì)胞生長抑制、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響；克隆形成能力實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染組細(xì)胞聯(lián)合放化療后克隆形成的情況。 5．用免疫組化法（SABC）檢測裸鼠移植瘤組織中TRAIL 的表達(dá)情況；觀察轉(zhuǎn)染真核基因表達(dá)載體hTERT-TRAIL 的HeLa 細(xì)胞裸鼠移植瘤成瘤情況及裸鼠生長情況，檢測聯(lián)合放化療后移植瘤終體積和質(zhì)量的變化，抑瘤率的變化。 結(jié)果: 1.TRAIL 在宮頸癌組織中

7、呈現(xiàn)低表達(dá)，與宮頸上皮內(nèi)瘤變、正常宮頸上皮組表達(dá)率三者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)；在不同組織學(xué)類型鱗癌與腺癌的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組呈現(xiàn)低表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;死亡受體DR4、DR5 在宮頸癌組織高表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 2. RT-PCR 檢測端粒酶啟動子調(diào)控TRAIL 基因表達(dá)載體TRAILmRNA 的表達(dá)強(qiáng)于其它組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)（P<0.01）；流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)

8、染hTERT-TRAIL 細(xì)胞凋亡率顯著上調(diào)（P<0.05），細(xì)胞的惡性增殖能力顯著降低（P<0.05）；免疫熒光顯微鏡檢測到在宮頸癌細(xì)胞株有特異性的綠色熒光蛋白GFP/TRAIL 的表達(dá)；透射電子顯微鏡觀察到端粒酶啟動子調(diào)控TRAIL 基因表達(dá)載體抑制宮頸癌細(xì)胞作用是以細(xì)胞凋亡為主。 3．端粒酶啟動子調(diào)控TRAIL 基因表達(dá)載體在體外能抑制宮頸癌細(xì)胞的生長，聯(lián)合化療增加了化療的敏感性；抑制作用有時(shí)間和劑量依賴性；流式細(xì)胞儀檢測

9、聯(lián)合化療后轉(zhuǎn)染hTERT-TRAIL 細(xì)胞凋亡率顯著上調(diào)（P<0.05），對細(xì)胞周期的影響以G1/G0 期細(xì)胞為主。 4．與化療組放療組相比較，聯(lián)合放化療后端粒酶啟動子調(diào)控TRAIL 基因表達(dá)載體在體外能明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(P<0.01)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡(P<0.01)，化療放療具有協(xié)同作用。 5. 免疫組化檢測結(jié)果顯示裸鼠移植瘤組織中有TRAIL 的表達(dá)；HeLa 裸鼠皮下移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn)表明：與化療組、放療組相比

10、較，聯(lián)合放化療端粒酶啟動子調(diào)控TRAIL 基因表達(dá)載體抑制了宮頸癌細(xì)胞HeLa 裸鼠移植瘤的生長，其抑瘤率亦明顯增加（P<0.05）。 結(jié)論: 1. 宮頸癌組織中TRAIL 表達(dá)下降，與腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。宮頸癌組織中死亡受體DR4、DR5 表達(dá)增高，與細(xì)胞分化相關(guān)。 2. hTERT 調(diào)控的TRAIL 可能通過提高宮頸癌細(xì)胞株HeLa 和SiHa 對TRAIL 的敏感性，引起宮頸癌細(xì)胞株的增殖能力下降,促

11、進(jìn)細(xì)胞的凋亡。 3. hTERT 調(diào)控的TRAIL 聯(lián)合化療對宮頸癌細(xì)胞株HeLa 有明顯抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)增加了細(xì)胞對化療的敏感性。 4. 裸鼠成瘤性實(shí)驗(yàn)表明: hTERT–TRAIL 對宮頸癌細(xì)胞HeLa 裸鼠移植瘤的生長有抑制作用，移植瘤質(zhì)量的抑瘤率提高。 5. 與單純放化療比較, 聯(lián)合放化療的轉(zhuǎn)染真核基因表達(dá)載體hTERT-TRAIL 組細(xì)胞對宮頸癌細(xì)胞株HeLa 在體內(nèi)和體外都有明顯