MiRo-1增加順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：觀察 Miro-1蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，并在順鉑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞株-HeLa細(xì)胞的凋亡時(shí)，探討 Miro-1蛋白如何影響順鉑的生理學(xué)效應(yīng)。最終提供某些宮頸癌患者產(chǎn)生順鉑化療藥物的耐藥性科學(xué)理論依據(jù)，并判斷Miro-1是否可成為順鉑治療宮頸癌患者的新的生物學(xué)指標(biāo)。
　　方法：利用 PCR擴(kuò)增得到目的基因，載入到載體質(zhì)粒中，通過(guò)細(xì)胞免疫組化及共聚焦顯微鏡確定內(nèi)源性 Miro-1蛋白及過(guò)表達(dá)時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器的定位。其次，

2、通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察宮頸癌細(xì)胞株-HeLa細(xì)胞的死亡率及死亡的類(lèi)型。利用蛋白印跡法確定PARP蛋白的切斷率，最終判斷過(guò)表達(dá)Miro-1蛋白可否增加順鉑誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞的凋亡率。最后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜通透性，并利用細(xì)胞免疫組化染色AIF蛋白,確定Miro-1蛋白如何增加細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　結(jié)果：（1）亞細(xì)胞器定位實(shí)驗(yàn)：通過(guò)細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)，觀察到內(nèi)源性Miro-1蛋白位于線粒體。同時(shí)利用 pEGFP-N1-Miro-1質(zhì)粒

3、與 pDsRed-Mito質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HeLa細(xì)胞，當(dāng)過(guò)表達(dá)Miro-1蛋白，同樣可存在于線粒體內(nèi)。（2）通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞死亡率，發(fā)現(xiàn)隨著Miro-1蛋白表達(dá)，可增加順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的死亡率，提示 MiRo-1蛋白表達(dá)與細(xì)胞死亡呈正比，過(guò)表達(dá) Miro-1蛋白24h及48h時(shí)，其細(xì)胞死亡率分別為24.2％和36.8%。（3）利用PI及Annexin V雙重染色法染色 HeLa細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)確定細(xì)胞死亡類(lèi)型，發(fā)現(xiàn) M

4、iro-1蛋白可引起細(xì)胞凋亡。（4）利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜通透性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)過(guò)表達(dá)Miro-1蛋白可增加線粒體膜的通透性，提示Miro-1蛋白可改變線粒體膜的完整性。（5）在HeLa細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)Miro-1后，利用順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，并進(jìn)行AIF免疫染色，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Miro-1可增加AIF蛋白由線粒體溢出至細(xì)胞核，增加HeLa細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：在宮頸癌組織中 Miro-1蛋白表達(dá)水平下降，在宮頸癌細(xì)胞株-HeLa細(xì)胞中