GAS5在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞順鉑耐藥性的影響.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大最常見的惡性腫瘤，其中我國宮頸癌的發(fā)病率較高。目前，手術聯(lián)合放、化療的綜合治療方式對宮頸癌的治療有顯著效果，80％的患者對鉑/紫杉醇類化療藥物敏感，但不少患者在治療后一段時間內(nèi)復發(fā)。長期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌患者的5年生存率高達90%以上，而晚期宮頸癌患者的5年生存率則徘徊在10%-30%。因此，宮頸癌診斷方法的完善及耐藥機制的明確顯得尤為重要。目前臨床存在的宮頸病變患

2、者診斷指標，能指導臨床醫(yī)生對患者分期判斷，但是沒有診斷患者病情的發(fā)展及預測耐藥程度的指標。因此尋找評估患者發(fā)展程度及耐藥能力的分子學標志物，探索宮頸癌耐藥的分子學機制以獲取有效的治療靶點是改善宮頸癌患者預后的重要研究課題。
　　繼miRNA的大量研究后，轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt的長鏈非編碼RNA（LongnoncodingRNA，LncRNA）在腫瘤中發(fā)揮的作用已引起極大關注。生長組織特異轉(zhuǎn)錄本5（Growtharrestedsp

3、ecific5，GAS5）是與腫瘤生長及預后密切相關的LncRNA，該基因的異常低表達與肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌等其他眾多人類實體腫瘤的進展也有密切關系，扮演抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的角色。此外，在一項關于GAS5對與乳腺癌細胞促凋亡因素反應的調(diào)控實驗提示了，GAS5的過表達能過促進多西他賽、5氟尿嘧啶等化療藥物對乳腺癌細胞的殺傷作用。目前，國內(nèi)外關于GAS5與宮頸癌的研究甚少，GAS5是否異常表達于宮頸癌組織、是否影響了

4、宮頸癌細胞的生物學行為及耐藥性、是否扮演了抑癌基因的角色及其作用機制如何等眾多問題尚不清楚，有待進一步探討。
　　第一部分GAS5在宮頸癌中的表達及對宮頸癌細胞生物學功能的影響
　　研究目的:
　　1、探討GAS5在宮頸癌組織的表達程度，分析其表達與臨床指標的關系；
　　2、細胞水平驗證GAS5對宮頸癌細胞HeLa、SiHa及CaSki增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；
　　3、動物模型進一步驗證GAS5表達

5、水平與宮頸癌細胞增殖能力的影響。
　　研究方法:
　　1、取廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦科40例宮頸癌術后患者的癌與癌旁組織，結合組織類型、組織分化程度及患者FIGO分期分析GAS5的表達與各指標的關系。
　　2、構建GAS5過表達慢病毒載體，分別感染宮頸癌細胞株，得GAS5穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株HeLa、SiHa與CaSki；設計GAS5-siRNA以抑制HeLa、SiHa與CaSki細胞GAS5的表達。
　　3、生物學功能

6、實驗檢測通過慢病毒過表達或siRNA抑制改變GAS5表達后，宮頸癌細胞生物學行為的改變。
　　1）CCK-8比色法檢測細胞生長曲線的改變；
　　2）流式細胞術檢測過表達GAS5后細胞周期及凋亡的情況；
　　3）Transwell遷移及侵襲實驗檢測細胞遷移、侵襲能力的改變；
　　4、構建宮頸癌SiHa細胞裸鼠成瘤模型，觀察GAS5穩(wěn)轉(zhuǎn)株與NC組生長在動物體內(nèi)的差別。
　　5、統(tǒng)計學分析
　　應用SPSS

7、19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結果以??±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用Fisher確切概率法和Student’st檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析和LSD檢驗，檢驗水準為α＝0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、GAS5的表達在宮頸癌組織中較癌旁組織要低，且降低程度與分化程度呈正比相關、與FIGO分期呈負相關。
　　2、GAS5慢病毒載體感染后有效提高GAS5表達量，GAS5-siRNA能有效抑

8、制GAS5表達。
　　3、CCK8結果提示過表達GAS5有效下調(diào)宮頸癌細胞株細胞的生長速度；而siRNA下調(diào)GAS5表達后細胞的增殖速度上調(diào)。
　　4、取GAS5穩(wěn)定表達的SiHa細胞進行凋亡實驗檢測，相對于對照組而言，細胞的凋亡率上升且細胞大部分停留在G0/G1期。
　　5、過表達GAS5能夠降低HeLa、SiHa及CaSki細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而抑制GAS5能夠增強HeLa、SiHa及CaSki細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

9、
　　6、GAS5能夠上調(diào)SiHa細胞在裸鼠體內(nèi)的生長速度，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1、GAS5在宮頸癌中低表達，且GAS5水平與宮頸癌分期及組織類型有相關性，或許能作為臨床診斷或治療指標。
　　2、作為抑癌基因，GAS5能夠在細胞水平上抑制細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，上調(diào)細胞的凋亡率。
　　3、GAS5在動物模型中亦能抑制SiHa細胞的增殖能力。
　　第二部分GAS5對宮頸癌Si

10、Ha及SiHa/cDDP細胞順鉑耐藥性的影響
　　研究目的:
　　1、構建SiHa細胞的順鉑耐藥細胞株SiHa/cDDP；
　　2、驗證GAS5及miR-21表達對SiHa及SiHa/cDDP順鉑耐藥性的影響。
　　研究方法:
　　1、逐步增加宮頸癌SiHa細胞培養(yǎng)液中順鉑的濃度從而誘導SiHa細胞產(chǎn)生耐藥
　　性，建立SiHa細胞耐順鉑細胞系。順鉑起始濃度為0.1μg/mL，逐漸遞增，待細胞能在此濃

11、度穩(wěn)定生長時，再進行下一個較高濃度的誘導。歷時8個月構建SiHa順鉑耐藥細胞SiHa/cDDP。
　　2、GAS5慢病毒載體感染SiHa及SiHa/cDDP細胞，構建GAS5穩(wěn)定表達的SiHa及SiHa/cDDP細胞。設計GAS5-siRNA、miR-21mimic及miR-21inhibitor處理SiHa與SiHa/cDDP細胞。
　　3、改變GAS5與miR-21表達水平后觀察SiHa細胞與SiHa/cDDP細胞順鉑敏

12、感性的改變。用不同濃度梯度的順鉑（1、2、3、4、5、6、10、15和30μg/mL）進行處理兩種細胞，CCK8檢測吸光度計算出細胞的存活率。
　　4、統(tǒng)計學分析
　　應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結果以??±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用Fisher確切概率法和Student’st檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析和LSD檢驗，檢驗水準為α＝0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、

13、成功構建SiHa/cDDP細胞（IC50=12.268μg/mL）的耐順鉑能力為SiHa細胞（IC50=2.14μg/mL）的5.7倍。倒置顯微鏡下可觀察到SiHa/cDDP形態(tài)教SiHa細胞發(fā)生變化，變得更加細長，個別甚至呈現(xiàn)狀。
　　2、GAS5慢病毒載體成功感染SiHa/cDDP細胞后成功上調(diào)GAS5的表達水平。3、過表達GAS5及抑制miR-21表達后，SiHa細胞的凋亡率提高；而抑制GAS5及抑制miR-21表達后，Si

14、Ha細胞的凋亡率下降了。
　　4、過表達GAS5及抑制miR-21表達后，SiHa/cDDP細胞的凋亡率上升，而抑制GAS5及過表達miR-21后，SiHa/cDDP細胞的存活率則上升。
　　結論:
　　1、GAS5及miR-21對宮頸癌SiHa細胞的順鉑耐藥性有調(diào)節(jié)作用，GAS5能增強順鉑對SiHa細胞的殺傷作用，而miR-21則能降低順鉑對細胞的殺傷作用。
　　2、GAS5及miR-21對宮頸癌SiHa/cD

15、DP細胞的順鉑耐藥性同樣有調(diào)節(jié)作用，GAS5能增強順鉑對SiHa/cDDP細胞的殺傷作用，而miR-21則能降低順鉑對耐藥細胞的殺傷作用。
　　第三部分GAS5對宮頸癌細胞生物學活性及順鉑敏感性影響的機制探討
　　研究目的:
　　分子水平上進一步論證GAS5通過靶向基因微小RNAmiR-21而調(diào)控抑癌基因PTEN及PDCD4的表達發(fā)揮抑制宮頸生長、轉(zhuǎn)移及耐順鉑的作用機制。
　　研究方法:
　　1、過表達或抑

16、制GAS5后檢測HeLa、SiHa及CaSki細胞的miR-21表達水平，過表達或抑制miR-21后檢測HeLa、SiHa及CaSki細胞的GAS5表達水平，觀察二者在細胞水平上的相互調(diào)控。
　　2、WesternBlot檢測GAS5水平的改變對PTEN及PDCD4蛋白表達的影響。
　　3、雙熒光素酶報告基因證實GAS5及miR-21存在直接調(diào)控關系。
　　結果:
　　1、三種宮頸癌細胞過表達GAS5水平后檢測m

17、iR-21的表達結果提示miR-21下降，而抑制GAS5表達后miR-21則上調(diào)，同樣改變miR-21表達水平再檢測GAS5表達得到相似結果，提示二者有相互調(diào)控關系。
　　2、改變GAS5的表達檢測PTEN及PDCD4，發(fā)現(xiàn)二者有正相關，說明GAS5能夠調(diào)節(jié)PTEN及PDCD4，且呈正向調(diào)節(jié)。
　　3、雙熒光素酶報告基因結果提示GAS5與miR-21存在結合位點，二者能直接調(diào)控。
　　結論：
　　1、GAS5與m

18、iR-21直接相互調(diào)控。
　　2、GAS5能通過miR-21調(diào)控PTEN及PDCD4發(fā)揮抑癌基因作用。
　　全文結論
　　1、GAS5異常低表達與宮頸癌，表達程度與臨床分期呈負相關；GAS5的過表達可以顯著抑制宮頸癌細胞HeLa、SiHa及CaSki的增殖、遷移及侵襲能力，增加宮頸癌細胞的凋亡率；而miR-21異常高表達于宮頸癌，表達程度與臨床分期呈正相關；miR-21能與GAS5直接結合相互調(diào)控，且GAS5或許能夠通