宮頸癌差異蛋白的表達(dá)及化療藥物對宮頸癌Hela細(xì)胞的作用.pdf

1、子宮頸癌是全世界婦女中最常見的惡性腫瘤之一，在我國一直高居婦科惡性腫瘤的首位，因此尋找早期診斷宮頸癌敏感而有效的方法就顯得尤為迫切。 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在臨床方面有著廣泛的應(yīng)用，尤其是能夠同時檢測出生物樣品中與某種疾病或環(huán)境因素?fù)p傷可能相關(guān)的全部蛋白質(zhì)的含量變化情況，對疾病的診斷或篩查、病情的進(jìn)展及預(yù)后、療效判斷等均有重要意義。蛋白質(zhì)組學(xué)為宮頸癌研究提供了新平臺，可從整體上全面、動態(tài)的定量分析比較正常及病變標(biāo)本中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的改

2、變，有助于闡明蛋白質(zhì)間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而有希望發(fā)現(xiàn)控制宮頸癌進(jìn)程的關(guān)鍵分子，為宮頸癌的診斷、藥物研究帶來新的思路和途徑。 研究目的： 1.尋找宮頸鱗癌早期和中晚期的差異蛋白質(zhì)，建立早期和中晚期宮頸癌的診斷模型。 2.了解化療藥物順鉑、紫杉醇、紫杉醇脂質(zhì)體單藥或聯(lián)合對宮頸癌Hela細(xì)胞的生長抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用。 研究方法： 1.檢測宮頸癌早期和中晚期差異蛋白質(zhì)的表達(dá) （1）樣品收集：宮頸癌

3、患者共44例，臨床分期為早期26例，中晚期18例。采集患者靜脈血，4℃離心后取上清，-70℃冰箱保存。 （2）用SELDI-TOF-MS、弱陽離子結(jié)合芯片，檢測血清蛋白質(zhì)峰，在Ciphergen ProteinChip3.1.1軟件中設(shè)定讀片程序，讀取芯片數(shù)據(jù)并繪制出蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。Biomarker Pattern軟件和Biomarker Wizard軟件分析蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰值，建立診斷樹模型。 （3）ELISA方法檢測血清

4、SCCA濃度（正常參考值<1.5ng/ml），以SCCA正常為對照組，SSCA高出正常值3倍以上為實驗組，應(yīng)用Biomarker Wizard軟件分析，檢測對照組與實驗組的蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰值。 2.化療藥物對宮頸癌Hela細(xì)胞體外生長的抑制作用 （1）宮頸癌Hela細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后實驗細(xì)胞分為6組：分別為空白對照組、DDP單藥組、Taxol單藥組、Liposome單藥組、DDP+Taxol聯(lián)合組、DD

5、P+Liposome聯(lián)合組。檢測細(xì)胞增殖抑制率時DDP藥物劑量分別為2.5、5、10、20μg/ml；Taxol藥物劑量分別為4.5、9、18、36μg/ml； Liposome藥物劑量分別為4.5、9、18、36μg/ml；DDP+Taxol聯(lián)合組藥物劑量分別為（2.5+4.5）、（5+9）、（10+18）μg/ml；DDP+Liposome聯(lián)合組藥物劑量分別為（2.5+4.5）、（5+9）、（10+18）μg/ml。檢測細(xì)胞凋亡時，

6、各組藥物劑量分別為；單藥組DDP10μg／ml、Taxol18μg/ml、Liposome18μg/ml，聯(lián)合組DDP+Taxol（10+18）μg/ml、DDP+Liposome（10+18）μg/ml。 （2）以MTT法檢測24、48、72小時后藥物抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的作用，根據(jù)OD值計算細(xì)胞生長抑制率。采用協(xié)同作用q值判斷DDP和Taxol聯(lián)用、DDP和Liposome聯(lián)用性質(zhì)：q>1.15為協(xié)同作用，0.85≤

7、q≤1.15為相加作用，q<0.85為拮抗作用。 （3）Annexin V-FITC/PI雙染法、流式細(xì)胞儀于藥物作用后24小時檢測細(xì)胞凋亡，并計算凋亡率。 （4）所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間細(xì)胞抑制率比較采用析因方差分析；其余均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），不同作用時間點各組間比較采用多重比較，方差齊性時采用LSD法，方差不齊采用Du

8、nnett's T3方法。同一時間同一濃度兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。各組間的藥物IC50值比較采用析因分析，不同作用時間點各組間的IC50值采用多重比較。細(xì)胞凋亡率的比較采用One-Way ANOVA，多重比較在方差齊性時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3方法。P<0.05（雙側(cè)）表示差異有顯著性。 研究結(jié)果： 1.官頸癌早期和中晚期差異蛋白質(zhì)的表達(dá) （1）宮頸癌早期與中晚期血清中共測得

9、79個蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰值，相對分子質(zhì)量在1002～18369范圍內(nèi)，其中43個質(zhì)譜峰值有顯著性差異（P<0.05），其中質(zhì)荷比（M/Z）為11523.83、11679.13、5841.076、7971.04、16109.71、15932.17、11480.07、5902.02、15861.78、18368.15、8141.23的差異蛋白質(zhì)在宮頸癌早期患者血清中含量明顯低于中晚期組，P<0.001。 （2）建立宮頸癌早期與中晚期的診斷

10、樹模型。模型一以單個差異蛋白質(zhì)11679.13（M/Z）作為分類變量，其分類正確率為93.18%（41/44）。模型二以單個差異蛋白質(zhì)5902.02（M/Z）作為分類變量，其分類正確率為81.81%（36/44）。 （3）將44例血清標(biāo)本根據(jù)SCCA值進(jìn)行分組，其中對照組為SCCA<1.5ng/ml，共22例；實驗組為SCCA≥4.5ng/ml，共16例。應(yīng)用Biomarker Wizard軟件分析，結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量100

11、2～18369范圍內(nèi)，對照組與實驗組共測得78個蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰值，其中43個質(zhì)譜峰值有顯著性差異（P<0.05），其中M/Z為11523.83、11679.13、5841.076、7971.04、16109.71、15932.17、11480.07、5902.02、15861.78、18368.15、8141.23的差異蛋白質(zhì)在對照組中的含量明顯低于實驗組，P<0.001。比對蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰值，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質(zhì)即26例宮頸癌早期組與18例

12、中晚期組血清之間的差異蛋白質(zhì)。 2.化療藥物對宮頸癌Hela細(xì)胞體外生長的抑制作用 （1）MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度DDP、Taxol、Liposome單獨作用于Hela細(xì)胞，增殖抑制程度隨著藥物濃度和作用時間的增加呈現(xiàn)增強的趨勢，表現(xiàn)為時間劑量依賴效應(yīng)（P<0.001）。隨著濃度的增加和作用時間的延長，DDP對Hela細(xì)胞的抑制率不斷增加，DDP20μg/ml作用72小時仍未出現(xiàn)明顯的平臺期。當(dāng)Taxol藥物濃度達(dá)到

13、36μg/ml時，對細(xì)胞的生長抑制作用不再隨著作用時間的延長而出現(xiàn)變化。Liposome對細(xì)胞的抑制作用也隨著濃度的增加更明顯，但作用時間較短時，濃度的增加并不能同步增加對細(xì)胞生長的抑制。 （2）聯(lián)合組藥物對細(xì)胞增殖的抑制作用也表現(xiàn)為時間劑量依賴效應(yīng)（P<0.001）。DDP+Taxol聯(lián)合低劑量組分別作用48小時與72小時對細(xì)胞的抑制率有明顯差異。并不是藥物濃度越高，作用時間越長，對細(xì)胞的抑制作用就越強，聯(lián)合中劑量組作用48小

14、時的抑制作用最強，此時的藥物作用已進(jìn)入平臺期。DDP+ Liposome聯(lián)合低劑量組隨時間延長抑制作用不斷增強，并且有顯著性差異；但中劑量組在48小時與72小時時的抑制作用已無顯著性差異，高劑量組出現(xiàn)相同結(jié)果。從作用時間來看，48小時后，中劑量組和高劑量組的抑制作用已無差異，72小時的結(jié)果同48小時?？偟膩碚f，DDP+Liposome聯(lián)合在作用到達(dá)一定時間（48小時）及藥物濃度（中等劑量）后抑制率不再增加。 （3）計算各組藥物的

15、IC50值并進(jìn)行分析，結(jié)果表明藥物作用時間越長、各組化療藥的IC50值越低。作用24小時，DDP+Taxol組與DDP+Liposome組無顯著性差異；作用48小時，DDP與聯(lián)合組DDP+Taxol、DDP+Liposome無顯著性差異；作用72小時，各組之間均有顯著性差異。 （4）協(xié)同作用q值判斷。DDP+Taxol的聯(lián)合，顯示了DDP、Taxol的協(xié)同和相加作用，隨著作用時間的延長，藥物濃度的增加，聯(lián)合組q值逐漸變小，最大的

16、q值為2.19，出現(xiàn)在聯(lián)合組作用48小時。DDP+ Liposome的聯(lián)合與DDP+Taxol的聯(lián)合結(jié)論一致，最大q值1.90出現(xiàn)在作用48小時。 （5）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡顯示，單藥與聯(lián)合用藥組均能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，與對照組比較，P<0.001；而且聯(lián)合組與單藥組之間也有顯著差別，聯(lián)合組間DDP+Taxol組的細(xì)胞凋亡率也顯著高于DDP+Liposome組。 結(jié)論： 1.宮頸癌早期組與中晚期組血清中存在差異蛋白

17、質(zhì)，以單個差異蛋白質(zhì)作為分類變量建立宮頸癌早期與中晚期的診斷樹模型，可以作為早期診斷及臨床分期的參考。血清SCCA升高，尤其升高至正常值3倍以上與臨床分期為中晚期有關(guān)。SCCA正常組與SCCA升高3倍組也可檢測到差異蛋白質(zhì)，與早期、中晚期組中存在的差異蛋白質(zhì)相同。 2.DDP、Taxol、Liposome單獨作用，對Hela細(xì)胞均有抑制增殖作用，并表現(xiàn)為一定的時間劑量依賴效應(yīng)。DDP+Taxol聯(lián)合、DDP+Liposome聯(lián)合